我国培育世界首例基因编辑克隆犬

　　还记得电影《一条狗的使命》里狗狗与人类深厚情感，狗狗带着几世的记忆寻找主人令人动容。狗作为我们的好朋友，寿命却只有普通人类的四分之一左右，如果有朝一日能够克隆出我们的爱犬，那不是很开心？ 

　　动图：一条狗的使命片段 

　　这不，北京希诺谷生物科技有限公司宣布他们或许完成了爱狗人士的这项心愿——经权威机构鉴定，该公司培育的比格犬“龙龙”与世界首例基因编辑疾病模型犬“苹果”同一认定几率大于99.99%，与代孕犬排除亲子关系，这证明了“龙龙”就是“苹果”的克隆犬。“龙龙”成为我国首例完全自主培育的体细胞克隆犬，也是世界首例基因编辑克隆犬。 

　　科研人员向记者展示世界首例基因编辑克隆犬“龙龙”（来源科技日报） 

　　那小伙伴们可能会问了，为什么克隆犬直到现在才“出生”？原来，由于犬体细胞克隆技术存在诸多瓶颈，犬被科学界普遍认为是最难克隆的动物之一，此领域的技术一直被韩国垄断。据悉，本次我国的团队是利用最新的基因编辑技术CRISPR/Cas9完成的此项任务，那么问题又来了，这个基因编辑技术又是啥？下面我们就来了解一下。 

　　CRISPR/Cas9技术 

　　“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。CRISPR/Cas9则是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。 

　　CRISPR/Cas系统的工作原理 

　　那么，这么厉害的技术，是如何操作的呢？ 

　　在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。 

　　1.“记录”入侵者档案 

　　其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图1所示）。 

　　图1 CRISPR序列示意图。其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列 

　　病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。 

　　当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。 

　　2、打击二次入侵者 

　　当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。 

　　图2 CRISPR/Cas9技术工作示意图（tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白寻找并切断靶点双链DNA，其中蓝色部分为Cas9蛋白，图片来源网络） 

　　正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。 

　　CRISPR/Cas9技术的应用：基因敲除 

　　以基因敲除为例，如图3所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(向导RNA1，向导RNA2)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。 

　　对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。 

 图3 CRISPR/Cas9技术敲除掉部分基因原理图（绘图 肖媛）

　　而DNA片断的插入或定点突变的实现，只需在此基础上为细胞提供一个修复的模板质粒，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。 

图4 CRISPR/Cas9技术插入新基因原理图（绘图 肖媛） 

　　当然，CRISPR/Cas9技术的成功率并非百分之百。向导RNA靶向序列的非特异性，以及DNA损伤修复的不确定性，都可能会导致基因组上其它位置产生未知的突变，也就是所谓的“脱靶”现象，这也是现阶段影响CRISPR/Cas9技术应用的瓶颈之一。 

　　但随着科研人员不断对Cas9蛋白的优化改造，对靶基因识别特异性的增强， CRISPR/Cas9技术的“打靶”效率将不断提高。  

　　CRISPR/Cas9技术的前景 

　　CRISPR/Cas9技术在医疗健康、生产生活、家畜育种等领域的应用不断取得喜人的新成果—— 

　　医疗健康领域，使用CRISPR技术根除HIV病毒、诱导宫颈癌细胞自我毁灭、构建癌症模型等最新成果先后被Nature等著名杂志所报道； 

　　在奶制品的发酵中，利用CRISPR/Cas9增强发酵菌株对噬菌体的防御能力； 

　　在家畜育种方面，也正在利用基因编辑工具通过对显著影响家畜生产性能的基因位点进行改良，以实现猪、牛、羊等大型家畜生产性能的提高等。 

　　但正如科学是把双刃剑，任何新技术的出现都少不了其反对者的存在，在CRISPR/Cas9技术得到热烈呼声的同时，不少人也对它提出了质疑，特别是对其脱靶事件可能导致基因组其他位置产生未知突变表示担忧。 

　　不过，正如所有的黎明前都是令人心慌的黑暗，CRISPR/Cas9技术纵使有诸多不确定，却还是在我们的努力下迎来了胜利的曙光，这次克隆犬的成功对于此项技术的开发应用具有重要意义，如若真的能与自己的爱犬相伴一生，未尝不是幸事一桩。