临床级间充质干细胞的技术壁垒：工艺制造

● ● ●书接上回，在上一期里，我们简述了以Alofisel、Temcell和Stempeucel为代表的商业化间充质干细胞疗法，同时也概述了我国干细胞临床研究和转化现状，最后指出了间充质干细胞药物开发面临的技术壁垒。
如果要开发一种“现货型”同种异基因间充质干细胞产品，异质性必然是是一道迈不过去的坎。如何去面对这个挑战，如何将间充质干细胞产品异质性的影响降到最低。
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间充质干细胞的基本概念

2006年，国际细胞治疗协会（ISCT）给出了间充质干细胞定义的最基本定义，也就是间充质干细胞最低的鉴定标准：从细胞形态，表面标记和分化能力三个方面定义了人类间充质干细胞（hMSCs）的最基本标准。MSCs在标准培养条件下，呈贴壁生长；

MSCs表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面标记；

MSCs在体外诱导可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞

然而，人类间充质干细胞最基本标准这只是反映了“干性”，而不是决定其治疗属性的免疫调节和血管再生作用。况且，不同来源的MSCs表面分子特征差异巨大。研究结果提示，不同组织来源的MSCs具有差异性（比如细胞大小、增殖潜能、分泌细胞因子种类和数量，免疫抑制能力也不尽相同）。

2019年，ISCT继续完善了MSCs的基本标准，增加了两点：第一，MSCs的组织来源。第二，与治疗疾病相关的MSCs功能测定。

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间充质干细胞产品的异质性

间充质干细胞疗法在某些疾病上取得了巨大成功，这的确让业内专家兴奋不已。纵观先前的大量临床试验，间充质干细胞疗法还存在一定的临床局限性。临床失败的关键在于，其免疫调节和血管再生作用在临床试验中具有不可预测性。究其本质，根源在于MSCs是一种活的药物，其关键质量属性（CQAs）很难界定。
间充质干细胞产品的CQAs

MSCs产品的常规检测，除了鉴定、活性、纯度、效力、增殖能力、基因组稳定性和微生物实验等评估外，还应检测与MSCs治疗功能相关的关键质量属性（比如抑制T细胞增殖或IDO表达）。

图1. 间充质干细胞的质控体系总览（步步先生绘制）

如何评价细胞产品的CQAs，这是细胞治疗领域面临的独特的一个挑战。传统的化学药品，其结构和效力是可以严格定义。而MSCs产品则不同，这是一种动态“活的药物”。

临床试验开始前，MSCs标准化产品的治疗效力是至关重要的。效力（Potency），FDA给出的定义是 “在适当实验室方法检测下或在预期方式管理条件下，通过大量临床数据获得产品的特殊能力或功能。” 通常，效力用来评价药物产生特定生理功能的浓度或数量，由强度（strength）和效果（effectiveness）两个因素组成，即相同强度（一般指浓度）下所取得的效果。

正是因为如此，开发一种针对MSCs产品效力的测定方法非常有必要，准确地将MSCs产品的CQA与它们的治疗功能相关联。目前，用于间充质干细胞产品效力最广泛的评价方法是：淋巴细胞增殖抑制试验。与免疫调节功能的替代标志物（即IDO表达或TSG-6表达）相比，显然不如后者被认为更能代表效力，因为它可以直接读出生物活性。

间充质干细胞产品的异质性

MSCs是一种异质性细胞群，其基因和蛋白表达谱图与很多因素有关（诸如供体特征，组织来源，分离方法，以及体外扩增培养方式）。不同供体、不同组织来源，甚至不同的制备工艺都可能会造成MSCs终产品出现异质性。

下面是MSCs异质性造成不同治疗效果：针对GVHD适应症，Mesoblast 公司开展的3期临床试验（NCT00366145）中，Remestemcel-L是来自1个供体扩增至3-4代的MSCs，以满足240名受试者的使用需求。临床试验结果比较积极，但未能达到主要临床终点。同样是针对GVHD适应，法兰克福大学医院开展的2期临床试验中，使用了来自8个供体混合的1-2代 MSCs，治疗26名患者，取得了77%的总缓解率。为什么会出现不同的临床结果?这是MSCs产品的异质性（供体不同，细胞代次不同，工艺不同）的原因，还是患者疾病个体化差异造成的的原因？需要肯定的是：如果干细胞采用自动化制备，既可减少制备过程中的人为操作因素，也能降低产品异质性风险。
目前，在制备过程中尽量避免MSCs产品异质性的策略有两种：▉ 生物材料

第一种是使用生物材料。在聚乙二醇水凝胶基质上，MSCs的扩增过程可避免细胞表面标志物和细胞因子表达的降低。3D培养系统也有利于MSCs在扩增过程中维持早期传代的表型。

▉ 诱导多能干细胞

第二种是使用多能干细胞。由于iPSC增殖能力更强，因此可以轻松扩增大量iPSC，然后再分化获得大量的MSCs。因此，iPSC-MSCs可能是规模化生产MSCs的有效解决方案。▉ 低温保存和复壮培养

MSCs产品异质性的另一大挑战，是冷冻保存对MSCs效力存在潜在的不利影响。研究发现，可以通“培养复壮”MSCs的方式来解决。
例如，Alofisel治疗肛周瘘管3期临床试验的成功，可能就归功于对解冻后的MSCs采用了“培养复苏”的策略，即在使用解冻的MSCs前进行短暂复苏培养，从解冻到输注需要至少24小时。这个研究成功表明，冷冻对细胞的不利影响是可逆的。

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如何增强间充质干细胞的治疗效果

如果建立MSCs产品效力的标准化质控方案，则有助于降低临床失败的风险。虽然不能完全避免临床失败，毕竟MSCs本身也不可治疗所有疾病，它不是包治百病的“万能神药”。临床试验表明，在保证安全性的前提下，MSCs的大剂量输注可保证某些临床应用的有效性。

为了最大限度地发挥临床效力，促进MSCs的“天然属性”，且独立于冷冻保存，扩增倍数，供体和组织来源等，我们可通过生物工程解决方案，可增强MSCs的“天然属性”。

图2. 如何增强间充质干细胞的“天然属性”

A）小分子“预处理”，可促进MSCs免疫调节和再生因子分泌。优点是简单有效，缺点是作用短，仅持续数小时至数天。

B）颗粒化处理，可维持MSCs免疫抑制很长时间，优点是不挑细胞，缺点是成本贵。

C）基因修饰出来，可通过基因修饰MSCs过表达某些因子，要么增强其固有功能，要么过表达其他治疗方法，要么改造成可用于癌症治疗的细胞。

D）溶瘤病毒处理，MSCs可屏蔽溶瘤病毒以躲避自身免疫细胞攻击，并在肿瘤组织中释放病毒以杀死肿瘤细胞。

小分子预处理

小分子“预处理”，是一种增强MSCs治疗效果的简单策略。其中最著名的就是Brainstorm公司的MSCs产品NurOwn®，其专利培养基（含GDNF、HGF和VEGF等）可诱导细胞分泌高水平神经营养因子（NTF），将MSCs转化为MSC-NTF细胞，后者可以直接递送至损伤部位，分泌多种神经营养因子和免疫调控因子，触发生物学效应，最终减缓或稳定疾病进展。

在II期临床试验（NCT02017912）中，渐冻人症患者在接受NurOwn®治疗24个月后，病情进展与对照组相比减缓。Brainstorm正在扩大NurOwn®的适应症范围，招募患者参加硬皮病（NCT03799718）的II期临床试验。
载药颗粒处理

小分子“预处理”虽然有用，但效果仅持续数小时到几天。因此，一种小分子封装微粒（MPs）也被用于提高MSCs产品的效力。MP含有生物相容性材料，可以根据其成分、分子量、载药量和药物释放速度，来调控MSCs产品的治疗作用。说白了，就是一种缓释剂。

与经游离的布地奈德（一种肾上腺皮质激素类药）“预处理”的MSCs相比，载有布地奈德的MP处理MSCs后，在体外显示出四倍的IDO活性增强。实验结果是：经IFN-γ刺激后，间充质干细胞产品对外周血单个核细胞（PBMC）的抑制作用提高了两倍。

基因改造

除了增强其“天然属性”，另一种策略是对MSCs进行基因改造，将其改造成生物制剂“生产车间”。为了在MSCs内产生所需的生物制剂，转导和转染是最常见的方法。
Suresh等人的一项研究表明，经过基因工程改造的MSCs，通过表达一种具有抗氧化作用的蛋白，在大鼠模型中改善了心肌梗死后的心脏功能。此外，还可以将MSCs改造成携带抗肿瘤药物的载体。MSCs可以避免免疫细胞追杀，利用肿瘤趋化性到达肿瘤部位，达到癌症治疗的目的。
溶瘤病毒处理

溶瘤病毒（OVs）处理也是一个策略，可直接裂解肿瘤细胞，或触发抗肿瘤免疫反应，通过MSCs作为其载体，定位到肿瘤部位，释放溶瘤病毒发挥作用。如果在MSCs中装载OVs，则可有效保护OVs免受机体破坏而影响其有效性，有点类似于“特洛伊木马”。使用MSCs作为OVs载体的一个限制是：MSCs在转导时仅表现出中等感染力。

基于溶瘤病毒技术联合MSCs疗法临床试验（NCT02068794），用于治疗复发性卵巢癌。临床前数据显示，用OV-MSCs治疗SKOV3卵巢癌小鼠后，小鼠寿命明显长于仅用OVs治疗的小鼠。

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文末小结

本期内容，我们简单介绍了MSCs的最基本标准，新增两条标准：细胞的组织来源和效力评价。在开始临床试验之前，MSCs产品效力的标准化是至关重要的。
然而，不同供体、不同组织来源，甚至不同的工艺制造都可能造成MSCs的异质性，这给临床结果稳定性制造了不小的挑战。我们可通过生物工程解决方案（小分子预处理，载药颗粒处理、基因改造和溶瘤病毒处理），可增强MSCs的治疗效果。
如果建立MSCs产品效力的标准化质控方案，则会降低其异质性的影响，有助于降低临床治疗失败的风险。当然，不同给药途径和患者适应症的选择也是影响MSCs临床成功的关键因素。下一期，我们将针对间充质干细胞的给药方式展开论述，敬请期待！