[科普中国]-免疫酶扩散法

琼脂凝胶免疫扩散试验(agar gel immunodiffusion，AGID)简称琼扩试验，是在琼脂凝胶中进行的抗原抗体免疫沉淀反应，可用于血清学定型，简便快捷。将待检的纯化细菌接种于固体培养基上，刮取培养24 h后的菌苔，悬浮于含85 g/L NaCl、0.02mol/L磷酸盐、3 m L/L福尔马林的溶液(pH 7.0)中，100℃水浴加热1 h，然后以1 500 r/min离心30min，吸取上清液即为待检抗原。通过观察待检抗原与标准抗血清之间是否形成明显、清晰可见的沉淀线，可以确定血清型。

免疫酶扩散法琼脂凝胶免疫扩散试验(agargelimmunodiffusion，AGID)简称琼扩试验，是在琼脂凝胶中进行的抗原抗体免疫沉淀反应，可用于血清学定型，简便快捷。将待检的纯化细菌接种于固体培养基上，刮取培养24h后的菌苔，悬浮于含85g/LNaCl、0.02mol/L磷酸盐、3mL/L福尔马林的溶液(pH7.0)中，100℃水浴加热1h，然后以1500r/min离心30min，吸取上清液即为待检抗原。通过观察待检抗原与标准抗血清之间是否形成明显、清晰可见的沉淀线，可以确定血清型1。

免疫酶扩散法的问题血清分离技术问题被检动物血清的分离是血清学试验的必需环节。根据凝血原理，从血液流出到血清析出的时间(健康状况下)，马为11.5分钟，牛为6.5分钟，绵羊为2.5分钟，猪为3.5分钟。在594份牛血液中，有289份采血后，在室温下斜置5-6小时，血液凝固不好，血面上有一层白色胶冻样物质而没有血清析出，将血液分组分别在1000℃rpm/分，2000rpm/分，3000rpm/分，4000℃rpm/分离心15-20分钟，同样没有结果。最后用无菌小玻棒划破血斜面，于37℃巨温箱放置30分钟后，再取出放于4℃冰箱内，15-20分钟就析出清澈透明血清，放置时间越长，析出的血清越多，一般5毫升血液可析出1-2毫升血清。

琼脂浓度的影响琼脂浓度决定琼脂凝胶孔径的大小，孔径与浓度呈负相关(反比)，孔径的大小直接影响抗原抗体分子的扩散，抗原分子量较大的，扩散时所需孔径要大，则要求琼脂浓度稍低，反之亦然。一般琼脂浓度在1%,0.8%，0.6%时，其凝胶孔径允许通过的抗原分子量分别在2×10^6,2.5×10^6,3×10^6道尔顿左右。我们进行牛粘膜病、口蹄疫、兰色病琼扩抗原与标准阳性血清预试时按规程要求操作，于37℃恒温箱48小时不出现沉淀线。经实验，是反复溶化琼脂时部份水份蒸发和恒温箱中湿度不够，使琼脂实际浓度过大影响了抗原抗体双扩散。

pH值、离子强度的影响反复溶化琼脂对pH值也有影炯，pH值过高或过低可使形成的抗原抗体复合物重新离解。一次性配琼脂量大，用不完，下次再溶化时不恻pH值，如此反复，使琼脂液酸碱度不精确而影响沉淀线的出现。所以每次溶化琼脂，制板前都要用NaOH和HC1重新滴定所要求的pH值。

免疫酶扩散法研究鸭疫里默菌鸭疫里默菌病是由鸭疫里默菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的主要侵害雏鸭、雏火鸡等多种禽类的急性或慢性的接触性传染病。在世界各养鸭地区几乎都有流行，特别是在东南亚国家。在我国由郭玉璞(1982)首次报道。该病多发生于2周龄～7周龄的小鸭，自然感染发病鸭临床表现为精神不振、食欲下降、嗜眠、歪颈、跛行、眼鼻有浆液性或黏液性分泌物，排黄绿稀粪，随后出现痉挛、摇头、角弓反张等神经症状，病愈的鸭体重减轻，生长迟缓。以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎为其病变特征。其发病率在5%～90%、病死率一般在1%～80%，高峰时可达90%甚至100%，目前已成为影响养鸭业最为严重的细菌性传染病，经济损失严重。在诊断上，根据其流行情况、临床症状和病理变化，一般可做出初步诊断，但确诊必须依赖于实验室技术手段。目前，RA的诊断方法主要有细菌分离鉴定、琼脂扩散试验、凝集试验、荧光抗体试验、间接ELISA、PCR、间接免疫酶组织化学法等。

PathanasophonP等根据琼扩试验结果，提出了20型和21型RA，程安春等提出了4个新的血清型即22型～25型，张大丙等先后鉴定出1，2，6，7，10，11，13，14，15型及17型共10个血清型，并将不同的10型分离株区分为5个亚型。虽然这个方法特异性比较高，但该试验结果反应了不同菌株之间的抗原差异，而非血清型的差异，最终的鉴定还需要依靠其他试验，并进行大量的细菌对比工作2。

免疫酶扩散法研究盖他病毒盖他病毒（Getahvirus，GETV）是一种单链线形的RNA病毒属披膜病毒科甲病毒属成员，该病毒广泛分布于亚洲地区及澳大利亚北部的太平洋沿岸地区。该病毒可以引起家畜疾病，如马的发热、皮疹、后腿水肿及淋巴结肿大，并能引起猪的流产等，因此该病毒被确定为重要的动物源性病原体。

免疫酶扩散法操作简单，但敏感性差。可选用病猪的脾、淋巴结和回肠小段为病料制备抗原，但以胰腺最好。用pH8．6的巴比妥缓冲液配制1．2%琼脂，内加万分之一柳硫汞防腐。按中央1孔、周围6孔的模式打孔，孔径5mm，孔间距6mm。检测抗原时，将高免血清滴入中央孔内，周围孔内分别加入标准抗原和待检病料乳剂。检测抗体时，将标准抗原滴入中央孔内，周围孔的上、下2孔内滴加高免血清，其他4孔滴加被检血清。此方法的最大缺点是误诊率高3。

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梁志宏 - 副教授 - 中国农业大学