[科普中国]-多位点可变数目串联重复序列分型-

多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis, MLVA)是一个基于PCR技术的分型方法，该方法通过区分基因组上多个具有多态性串联重复序列位点(VNTR)的重复数来区分菌株。串联重复数不同的核酸片段经位于串联重复的两端引物扩增，通过琼脂糖电泳、测序或毛细管电泳确定扩增产物大小，进而确定串联重复数。此方法分辨率高、重复性好、快速、简便，可用于流行病学溯源分析。

病原菌分型研究方法近年来，有很多分子生物学方法被用于病原菌的分型研究，如:多位点序列分析(Multilocussequencetyping,MLST)、限制性长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、随机扩增多态性DNA(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)、插入序列100(IS100)、核糖体分型(Ribotyping)和多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple-locusvariable-numbertandemrepeatanalysis,MLUA)等1。

可变数目串联重复序列可变数目串联重复序列（variable-numbertandemrepeat，VNTR）,是指一些广泛存在于真核和原核生物基因组中,以一段相同或相似的核苷酸序列为重复单位（也称为核心序列）首尾相连重复的序列。它们在不同的个体之间由于重复数的不同,而造成生物的多态性。人们根据其核心序列长度的不同,将串联重复序列分为以下三种：卫星DNA（核心序列长度大于100个核苷酸）、小卫星DNA（核心序列长度在10-100核苷酸之间、微卫星DNA（核心序列长度小于10个核苷酸）。

多位点可变数目串联重复序列分析多位点可变数目串联重复序列分析(MultipleLocusVariable-numbertandemrepeatAnalysis,MLVA)是一个基于PCR技术的分型方法，该方法通过区分基因组上多个具有多态性串联重复序列位点(VNTR)的重复数来区分菌株。串联重复数不同的核酸片段经位于串联重复的两端引物扩增，通过琼脂糖电泳、测序或毛细管电泳确定扩增产物大小，进而确定串联重复数。此方法分辨率高、重复性好、快速、简便，可用于流行病学溯源分析2。

MLVA的优点1)不同位点的串联重复序列的多态性不同，多个位点的VNTR分析有很好的分辨能力；

2)VNTR是较短的DNA结构，受染色体DNA重排的影响很小；

3)MLVA建立在PCR方法之上，仅需要普通的模板，所需的设备、技术都较容易掌握，而VNTR芯片使得操作更加简单，可以快速获得结果；

4)不同实验室之间的数据可以进行相互交换、整合与分析，已有网站提供了多个细菌全基因组序列的VNTR位点分布情况；

5)许多细菌基因组已完成了序列测定，有利于VNTR的识别和相应位点引物的设计。

有实际意义的VNTR位点可以用于基因分型和系统进化分析。所有这些使得MLVA成为有前途并容易推广的一种分子生物学方法。通过MLVA在基因水平上建立稳定的遗传标识，系统查明我国鼠疫菌的分布特点，可用于对鼠疫菌进行基因分型、流行病学调查，追溯感染的来源、甚至追踪其进化过程中的亲缘关系，在反生物恐怖的工作中也具有重要的意义。

MLVA在布氏菌病监测中的应用传统的布氏菌表型分型方法主要有染料抑菌试验、氧化酶、触酶、硫化氢试验、血清学试验以及噬菌体裂解试验。这些试验操作繁琐，试验周期较长，而有些实验有生物危害。随着分子生物学的发展，使用PCR方法来分型定成为趋势，刘国栋等建立了多重PCR的方法检测布鲁氏菌、姜海等用AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定。MLVA是用可变数目的串联重复序列为基础，建立起来的分析方法，因其操作简单，分辨率高，具有较高的可重复性，结果易于分析，已经渐渐成为一种可以取代传统分型方法的新型分型方法。

MLVA分析方法包括两套引物，其中panel1由8个位点(重复单元:12-134)组成，为布氏菌种的鉴定指标，其串联重复序列可变重复数目可通过2%琼脂糖凝胶电泳判定；panel2也由8个位点(重复单元:6-8)组成，为高变异度指标，其串联重复序列可变重复数目可通过毛细血管电泳判定。选取了15株羊种菌、22株牛种菌、21株猪种菌和l}株犬种菌株，通过聚类分析显示，四个种分别聚在一个簇，说明MLVA的分型方法可以用于布氏菌种之问的区分。其中一株猪种3型菌株bru1018与犬种菌聚为一簇，这暗示猪种3型菌株与犬种菌在进化关系上十分接近。通过将VNTR位点重复数输人数据库中，可以确定panel1,panel2A和panel2B的类型，不仅可以用于分型研究，更重要的是用于菌株间基因型的比较，从而分析布氏菌优势菌株及追溯传染源。

通过对疫区流行菌株的基因型特征分析，不仅可以反映不同疫区流行优势基因型和流行形式的变化，还可有助于准确判定疫区的类型以及科学防治布病。对同一盟(市)不同年代的分离株进行基因型特征分析，不仅可以反映出与时间、地域的流行病学关联性，而且对该盟(市)布病的流行趋势的监控具有一定指导意义。通过采用标准化的MLVA分型技术，建立MLVA分型数据库，及时对分离株分型比对、发现特征型别的簇，提出预警信息，进而结合流行病学调查发现暴发关联，尤其是发现散在分布于不同地理区域的暴发关联，查找危险因素，明确传播途径，追溯传染来源。MLVA方法必将成为布病监测中不可或缺的工具之一3。

本词条内容贡献者为:

梁志宏 - 副教授 - 中国农业大学