[科普中国]-生物毒素形态分析

生物毒素是一类具重要的生物源化学物质，具有广泛的民用价值和军事意义。生物毒素形态分析可以采用理化分析法、免疫学方法、高效液相色谱法等方法。

生物毒素生物毒素(biological toxins)是生物机体分泌代谢或半生物合成产生的、不可自复制的有毒化学物质，包括动物、植物、海洋生物和微生物等产生的对其它生物物种有毒害作用的各种化学物质。生物毒素的研究具有广泛的民用价值和军事意义。作为治疗药物、抗癌导向药物和预防疫苗，生物毒素及其作用机理、效力等的研究尚在积极的探索之中；由于生物毒素毒性较高，可发展成为一种潜在的生物武器，对人类健康和国家安全构成了潜在的巨大威胁。因此，生物样品和环境样品中痕量生物毒素的检测已成为各国关注的重点，发展毒素的检测、鉴别和防护手段也成为当前国际反恐工作的迫切需要。生物毒素的分析检测早期主要通过动物实验、常规免疫方法及普通理化分析手段等进行。近年来，随着分析技术的不断发展，生物质谱、色谱质谱联用和各类新型传感技术越来越多地应用于生物毒素的检测中，使生物毒素的定性与鉴别更加准确，分析的灵敏度和特异性也有很大地提高。

海洋生物毒素——河豚毒素和石房蛤毒素
河豚毒素(tetrodotoxin, ttx)属于小分子非蛋白质类神经性毒素，分子式c11h17n3o8，分子量319.3， ld50(半数致死量)为8 μg/kg(小鼠，ip.)，曾一度被认为是自然界中毒性最强的非蛋白类毒素。有报道称在欧洲捕捞的海螺引发了河豚毒素中毒事件，该种属的海螺ttx含量惊人，1只可致10个成年人死亡。ttx不溶于有机溶剂，易溶于有机酸和无机酸水溶液，ph 3～7，对热稳定，在强酸强碱条件下不稳定，主要降解产物为c9碱。
石房蛤毒素(axitoxin, stx)属麻痹性贝毒素(psp)。它是海洋生物中毒性很高的小分子麻痹性神经毒素，小鼠ld50为8 μg/kg。其分子式为C10H17N7O4，分子量299。纯品为白色固体，易溶于水，不易被消化酶破坏。石房蛤毒素主要作用于突触前膜，可阻断突触后膜的Na+通道，导致一系列的中毒症状。

生物测定法
细胞毒性法是检测stx常用生物测定法之一，主要基于stx作为钠通道阻断剂对细胞生物活性的影响实现检测。okumura等通过加入刺尾鱼毒素（maitotoxin），将孵育时间从1～2 d降至6～8 h，实现了快速细胞生物分析。应用神经瘤细胞建立的psp的体外检测模型，测得几种psp的毒性大小为：stx > dcstx > neostx > gtx1,4 > dcneostx > gtx2,3 > dcgtx2,3 > gtx5。

理化分析法
沈晓书等在ttx的荧光检测法中应用微波辅助碱解法提高ttx的水解速度和c9碱的产率。在碱解体系中，以水和异丙醇作为混合溶剂使荧光强度得到显著提高，该方法可检测16 μg/l ttx。
液相色谱-质谱联用技术(lcms)可对ttx直接进行检测。对于全血和尿液等生物样品，以c18或活性炭固相萃取柱对样品进行预处理，结合液相色谱-电喷雾串级质谱(lc-ms/ms)可检测低于10 μg/l的ttx。gc-ms方法则需将ttx降解成为c9碱并对其进行衍生化方可检测，检出限(lod)可达1 ng。

免疫学方法
常规酶联免疫吸附法(elisa)主要基于游离的ttx竞争抑制以碱性磷酸酶(ap)标记的mab与检测抗原的结合反应，最新报道则以碱性磷酸酶标记ttx，通过直接竞争免疫抑制法实现对ttx的检测，其检测灵敏度为2 μg/l。免疫亲和柱层析法通过抗原抗体的特异性结合实现ttx的捕获和富集，亲和柱上洗脱的ttx与其mab的结合产物以高效液相色谱-荧光检测器(hplc-fld)检测，lod为2 μg/l。
各种基于免疫学原理的新型传感器相继用于ttx的检测。基于表面等离子体共振技术(spr)的传感器是将具有特异识别属性的分子(即配体)固定于金属膜表面，监控体系中被分析物与该配体特异性结合导致的金属膜表面体系的折射率发生变化，从而实现检测，具有无需标记，快速灵敏等优点。将ttx化学键合在自组装单分子层膜(sam)修饰的金膜表面以抑制法测定定量ttx抗体与样品中ttx结合后剩余的ttx抗体，从而实现对ttx的定量检测。该方法ic20(20%抑制浓度)和ic50(50%抑制浓度)处的lod分别为0.3和6 ng/l。电化学免疫传感器结合了电化学放大作用与免疫电极的特异性。在一次性丝网印刷碳电极上覆盖bsattx包被物，然后加入游离的ttx和碱性磷酸酶标记的ttx mab，特异性结合引起的电流变化以安培计检测，从而间接求得ttx含量。该方法最低可检出16 ng/l的ttx。

真菌毒素——黄曲霉毒素和t2毒素
黄曲霉毒素(aflatoxin, af)是一种杂环分子，具有强致癌力。其作用的靶器官主要为肝脏，可导致肝细胞癌变。afb1是全部黄曲霉毒素的亚型中毒性最强的，小鼠ld50为9 mg/kg，其结构稳定，耐热能力强，是已发现真菌毒素中最稳定的一种，但易被碱或强氧化剂破坏。
t2毒素(t2 toxin)是单端孢霉烯族毒素之一，属a型单端孢霉烯。分子式：c24h34o9；分子量：466.2。不同种动物ld50范围在1.0～14.0 mg/kg体重。t2毒素主要作用于增殖活跃的细胞，对淋巴细胞的损害最为严重。t2毒素纯品为白色针状结晶，易溶于有机溶剂，不易溶于水。其性质稳定，仅碱性条件下次氯酸钠可使之失去毒性；环氧基团和双键被认为是活性单位。

高效液相色谱法
高效液相色谱法(hplc)是检测真菌毒素的常用方法之一。应用荧光衍生化试剂蒽腈对t2毒素进行柱前衍生化，以免疫亲和色谱柱分离，lod为5 μg/kg(谷粒)，回收率80%。气相色谱质谱法(gc-ms)是t2毒素应用最广泛最灵敏的检测方法，可以同时检测几种不同类型的单端孢霉烯族毒素，在多种毒素混合污染时更具独特的优越性。采用ncigcms可检出低至1 fg的t2毒素。本实验室对镰状镰刀菌菌株产毒培养物中的有毒代谢产物采用gc-ms鉴别，并对其中的主要毒素采用单离子选择模式进行了定量分析。以c18作为分散材料的基质固相分散法对油性基质进行预处理，无需后续处理即可去除基质中的油脂。结合lc-esi-ms/ms分析预处理后的样品，可同时检测4种亚型的黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2，lod为20～90 ng/kg。

免疫学方法
免疫层析法结合了免疫的高特异性和层析法快速简便的特点，样品借助毛细作用在条状纤维制成的膜上泳动，黄曲霉毒素被固定于膜上特定区域的含有胶体金探针的抗体捕获并富集，以纤维膜上显色条的有无或多少来定性或定量，几分钟便可得到直观结果。该金标试纸条可检测食物中2 μg/kg的黄曲霉毒素，准确率大于95%。荧光偏振免疫测定法[16]基于毒素与抗体结合后分子质量增大，分子旋转速度降低从而导致荧光偏振值增大的原理，荧光标记的毒素在样品中同无荧光标记的毒素与特异性抗体竞争性结合，通过测定荧光偏振值的变化实现检测。该方法可检测不同谷物中低至5 μg/l的afb1，但与b2、g1和g2亚型有约30%的交叉反应。
对于海洋生物毒素和真菌毒素等小分子毒素，生物测定法、组织培养法以及薄层色谱法等由于检测成本低，对设备要求不高等特点，在基层实验室检测中仍有广泛应用。气相、液相等色谱方法不仅在定量分析中具有较大优势，在选用合适的检测器(如fld)和样品预处理方法(如柱前衍生化)后可成为检测小分子毒素最灵敏的方法之一。色谱质谱联用技术在定量检测的同时可对毒素进行准确的定性鉴别，成为科研和实验室检测的主流方法。免疫层析法和荧光免疫法等技术将免疫检测的高特异性与光谱法的高灵敏度或色谱法的分离、富集作用有效整合在一起，可对小分子生物毒素进行快速、准确的鉴别，成为现场快速侦检和筛查的主要手段1。

动物毒素——蛇毒
蛇毒是毒蛇的毒腺分泌的毒液中毒性成分的总称，主要含有4类物质：酶、神经毒性多肽、神经生长因子和膜活性多肽，其中神经毒性多肽被称为蛇毒素。新鲜的毒液呈蛋清样粘稠液体， 弱酸性，常温下易失活。经甲醛处理失去毒性，但仍保持其抗原性。α-银环蛇毒素的ld50(小鼠，ip.)为0.128 mg/kg。

生物质谱法
生物质谱的优点在于能够准确测定蛇毒蛋白的氨基酸序列，从而实现对不同种属的蛇毒进行种间鉴别。应用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱-检测-蛇毒蛋白，最低定量限为10 ng。以凝胶渗透色谱和反相hplc-将有效肽段从3种蛇毒中分离出来。

免疫学测定法
光学免疫分析(oia)基于spr原理，将单分子层薄膜涂在硅芯片基质表面，蛇毒与薄膜的特异性结合会导致入射白光产生金黄色至蓝紫色的反射光。该方法可对血、尿等生物样品中的4种类型的蛇毒的原型同时进行定性和半定量检测，lod为0.2～1.6 μg/l。荧光免疫技术结合了荧光检测的高灵敏度和免疫法的高特异性，以聚苯乙烯微球为载体，半导体量子点为荧光标记试剂，将蛇毒抗体固定于表面羧基化的具有不同颜色的微球上，加入蛇毒使之与抗体结合，再加入结合有量子点的蛇毒抗体，与蛇毒结合形成抗体-抗原-抗体复合物，实验结果可通过紫外显微镜直接观测。该方法对naja kaouthia蛇毒的lod为5～10 μg/l2。

本词条内容贡献者为:

梁志宏 - 副教授 - 中国农业大学