[科普中国]-肽核酸芯片

芯片的载体的预处理

芯片制备之前要对载体进行修饰，使其表面有可进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联，并使载体具有良好的稳定性和生物兼容性。对支持物进行表面处理的原因有两方面。首先，支持物表面上要有一种合适的功能基团以连接探针，并使探针稳定地固定于支持物表面，以防止杂交后清洗时被洗脱。经处理后其表面衍生出氨基、醛基、异硫氰酸基及环氧基团。这些活性基团可与DNA分子中的磷酸基、氨基、羟基等基团形成离子键或共价结合而使打印在上面的DNA牢固地固定在支持物表面。其次，支持物表面经处理后．可减少亲水性探针在其表面的扩散，因而提高了点阵密度。

基因芯片的制作方法基因芯片的制作一般有两种方法，一种为原位合成(insitusynthesis)．适用于寡核苷酸；一种为合成后交联(post—synthetic attachment)也叫点样法。

①原位合成法。此方法制作的芯片常被称作DNA芯片，即在芯片上原位合成寡核苷酸探针，合成的探针被直接有序地固化于支持物上，以用于杂交分析。原位合成法制备的芯片是高密度的，核酸探针长度较短，最适用于DNA再测序、查明点突变，以及基因转录表达分析等。

光导原位合成法是常用的原位合成法，它是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子(linker)，其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去。用特制的光栏(light mask)(光刻掩膜，photoliographic mask)保护不需要合成的部位，而暴露合成部位。在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其他位点加上另外3种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要有4N个步骤。每一独特序列的探针称为一个“feature”．这样的芯片便具有4N个“feature”(探针位点，每个探针位点含有几百万个相同的探针)，包含了全部长度为N的核苷酸序列。这种原位合成的方法无需制备处理克隆和产物。运用这种方法制作的芯片探针间隔为5～10μm，密度可高达106探针/cm2。该方法的优点在于合成速度快、步骤少、合成探针阵列量大；缺点是合成反应产率较低，不到95%，探针长度较短，一般为2～8 bp。此外，如果每步去保护不彻底会导致杂交信号模糊，信噪比减低。为此，有人用电子射线和酸作为去保护剂以提高产率及点阵密度。

②点样法。点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上，然后经过紫外线照射或Schiff碱连接法固定、变性、冲洗和晾干而成。以此方法制作的芯片也被称为微点阵(microarray)，可将较大的核酸片段(大于100 bp)物理地固定在介质上。该方法的探针制备是在芯片以外采用常规分子生物学技术获得的，如PCR、分子克隆、人工合成DNA片段等。将制备好的探针通过手工或自动点样装置点在经特殊处理的载玻片或其他材料上即可，主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。探针可以是合成的短寡核苷酸片段，也可以是从基因组中制备的基因片段或cDNA；可以是双链，亦可采用单链的DNA或RNA片段。也有人用肽核酸(peptide nucleic acids，PNA，一类DNA类似物，以氨基酸取代糖磷酸主链)制成探针。

样品制备及样品的标记方法样品的制备和标记是基因芯片实验流程的一个重要环节，待分析基因一般不能与芯片探针直接杂交，在杂交之前必须进行分离、扩增和标记。根据样品来源、基因含量和分析目的不同，采取的基因分离、扩增和标记的方法不同。常规的基因分离、扩增和标记技术完全可以采用。样品的标记方法有放射性核素标记法及荧光色素法等。放射性核素标记法中33P dCTP是首选的放射性标记物。因为其放射能量较大，尤其是在芯片上各个探针的物理距离较近时，杂交信号强的位点容易影响到邻近的杂交信号弱的位点的情况下，选用33P dCTP可以更好地检测出杂交信号弱的位点的信息。除了33P外．其他的放射性标记物还有3H、14C、35S等。放射性核素标记物的缺点是其放射污染。

荧光色素法中最常用的是Cye3一dUTP和Cye5一dUTP。其优点是和逆转录产物有很好的结合性能、好的光稳定性以及它们的激发光谱和发射光谱范围差别较大，使得光学检测时分辨率较强。另外比放射性核素还有一个明显的优点就是能够避免放射污染。但是信号较弱，易受背景噪声的干扰，尤其是当待测物质的量较少时，检测的敏感性不佳。

生物分子杂交反应基因芯片与检测基因的杂交过程与一般的分子杂交过程基本相同，但杂交条件的选择需考虑多方面的因素，如杂交反应体系中盐浓度，探针的浓度、GC含量、所带电荷、序列组成，检测基因序列的浓度，探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构以及杂交的时间、温度、芯片的类型等因素。如用于基因表达检测，需要长历时、低温和高盐条件的较严谨性杂交，而用于突变检测则需要短历时、高温和低盐条件高严谨性杂交。由于基因芯片影响因素很多，所以要合理设置异种核酸平行实验、核酸质量、检测对照、封闭对照、归整化对照，以保证结果的准确性和重复性。

最近，为提高芯片杂交的准确性，出现了肽核酸芯片(peptide nucleic acid miroarray，PNAmicroarray)，PNA与互补的DNA或RNA杂交时，比类似的DNA寡聚物有着更高的亲和性，而且PNA很稳定，对提高基因芯片的检测效果，防止假阳性方面有一定的进步。

杂交反应的信号检测及分析芯片经杂交反应后，各反应点形成强弱不同的光信号图像，用芯片扫描仪和相关软件加以分析，即可获得有关的生物信息。如果是用同位素标记样品，其后的信号检测即是放射自显影，通过放射自显影显示杂交信号的强弱与分布；若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，经计算机软件如Genepix 3.0软件ImaGene 3.0软件分析，将图像数字化，即可获得有关的生物信息。

目前，用于芯片的荧光信号扫描和定量分析方法主要有两种：①利用电荷耦合装置(charge—coupled devices，CCD)检测的摄像系统；②利用激光共聚焦原理基于光电倍增管(photomulti—plier tube，PMT)检测的扫描系统。由于基因芯片获取的信息量大．所以对基因芯片杂交数据的分析、处理、查询、比较等需要一个标准的数据格式。目前，一个大型的基因芯片的数据库正在构建中，若能将各实验室获得的基因芯片的结果集中起来，那么今后对数据的交流及结果的评估与分析将非常有利。近年来还发展了多种检测方法，如质谱法、化学发光法、光导纤维法等1。