[科普中国]-PH值增值法

滴定法和pH增值法

滴定法是国家标准方法(标准编号GB/T1356787—1997)，具有仲裁性。但是由于滴定法要求精度高，所用试剂品种较多，且配制复杂，测定过程中操作时间较长，操作步骤较严格，给检测人员的批次测定带来不便，难以迅速地指导生产。所以在实际生产中，一般多用pH增值法测定酶活性。pH增值法由于测定结果的准确度和精确度都不高，因此，不具有仲裁性。

虽然用滴定法和pH增值法测得的酶活性的数据有较大差别，不能直接通用，但是可以根据它们之间的联系，建立一定条件，找到一种简便易行的方法进行数值间的相互代换，从而实现实验过程的以简代繁，以达到迅速、高效地指导实际生产的目的。

脲酶活性的定量测定—pH增值法1、测定原理

大豆饼粕与中性尿素缓冲液混合，在30℃恒温条件下，脲酶催化尿素水解产生氨使溶液pH值升高。试样反应30min后，与空白溶液的pH值之差可间接表示氨量的多少，从而反映脲酶活性的高低。

2、试剂与溶液

①磷酸缓冲液：0.05mol/L。称取3.403g磷酸二氢钾(KH2PO4)，溶于100ml水中。再称取4.355g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于100ml水中，合并上述2种溶液并稀释至1 000ml。使用前应用酸溶液或碱溶液调节pH值为7.0。缓冲液保存期90d。

②尿素缓冲液：称取15g尿素，溶于500ml磷酸缓冲液中，调节溶液pH值为7.0。为防止细菌滋生，可加入5ml甲苯。

3、仪器设备

①酸度计：具有玻璃电极、甘汞电极；精度0.02pH值。

②恒温水浴：可控制温度(30±0.5)℃。

③具塞刻度试管：直径18mm，长150mm。

④粉碎机：粉碎时应不生强热(如球磨机)。

⑤样品筛：孔径400μm。

⑥分析天平：感量0.0001g。

4、测定步骤

①准确称取(0.200±0.001)g样品于试管(A管)中，加入20ml中性尿素缓冲液，立即加塞混匀，30℃恒温水浴中准确保持30min。在混合操作时切勿倒置试管。

②空白试验须准确称取(0.200±0.001)g样品于试管(B管)中，加入20ml磷酸缓冲液，立即加塞混匀，30℃恒温水浴中准确保持30min。在混合操作时切勿倒置试管。

上述试验的制备和空白试验的制备须相隔5min，水浴期间每5min摇匀试管内容物一次。

③30min后，依次从水浴中取出试管，将上层液体移入小烧杯中，在水浴中取出刚达5min时，分别测定溶液的pH值。

5、结果计算

试验溶液pH值与空白溶液pH值之差即为尿素酶活性的指数。

尿素酶活性=A-B

式中：A—A管的pH值；

B—B管的pH值。

6、注意事项

①应提早一天浸泡电极，保持电极清洁。

②有时样品中的可溶物会附着在电极上，使电解质经过甘汞电极的多孔纤维流动速度降低，因此测定溶液的pH值时应快速1。