[科普中国]-单克隆位点

克隆

克隆是英文"clone"或"cloning"的音译，而英文"clone"则起源于希腊文"Klone"，原意是指以幼苗或嫩枝插条，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。在大陆译为“无性繁殖”，在台湾与港澳一般意译为复制，转殖或群殖。 中文也有更加确切的词表达克隆，“无性繁殖”、“无性系化”以及“纯系化”。克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因的个体或种群1。

柯斯质粒载体单克隆位点柯斯质粒载体(eosmid vector)又叫黏粒载体，这是一种由人工构建的含有DNA的COS序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒在结构组成上具有A噬菌体的特性，也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入35～40 kb的外源基因，这是构建真核生物基因文库的主要载体。

柯斯质粒上带有多个单克隆位点(RF2)、两个COS位点、DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个COS位点之间还有一个限制性内切酶位点(RE1)。克隆时，先用REl将柯斯质粒切开，再用单克隆位点中的某个限制性内切酶(RE2)酶解，然后将用经RE2酶解的大约40 kb大小的外源DNA片段克隆进单克隆位点，形成一个长大约50 kb的线性DNA分子，这个DNA分子由于含有两个相距约50 kb的cos位点，因此可以在体外包装进入空的噬菌体的头部，没有插入DNA的空载体或插入片段大小不符合要求的重组分子则无法包装。重组噬菌体的DNA可以通过浸染大肠杆菌而传递。一旦进入大肠杆菌，由于进入头部时两个cos位点都已切割掉了，它们通过碱基配对可以将整个DNA分子变成一个环状的质粒分子，复制起始位点的存在又可以保证其在宿主细胞中稳定复制保持，转化的细胞可以通过抗生素进行筛选。柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克隆，如图12。

质粒载体的多克隆位点现在几乎所有的基因工程载体都含有一个人工合成的密集排列的系列多克隆位点，称为载体多克隆位点，或称多接头或称限制性酶切位点库，由常用的限制性内切酶所能识别的序列组成。这些酶切位点一般都是单一的，在质粒其他部位不再有这些位点。这样就提供了质粒单独或联合使用时的便利，并可选用任一种或几种酶作酶切后能产生合适的DNA片段。这种片段有合适的末端接头，也简化了对外源DNA片段进行限制性酶酶切作图工作。将所有可能的克隆位点汇集于质粒的同一位置，不利之处是不能利用选择标志的失活来筛选重组体。但这一缺点可用别的方法来弥补。例如将一连串克隆位点引入到某种酶(如β一半乳糖苷酶)的一个具有特殊活性片段的编码基因中，外源DNA插入使之出现非活性片段。由于重组克隆失去了水解生色底物酶的能力，可根据颜色使重组体与非重组体分开3。