[科普中国]-组织特异性表达载体

几种特殊用途的克隆载体启动子探针载体

启动子是调控基因有效转录的必备元件，是构建基因表达载体的重要组成部分，在研究生物发育机制、提高目的基因表达产量和进行基因治疗等方面起着重要的作用。分离不同类型基因启动子已成为基因工程的重要任务之一，而启动子探针(promoter probe)载体则是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具。启动子探针载体除了质粒载体必备的元件外，还必须含有检测部件。检测部件有两部分组成，即一个已失去启动子且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。目前用作检测遗传标记基因主要有抗生素抗性基因和绿色荧光蛋白基因等。

诱导型表达载体诱导型表达载体指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体。外源基因处于这样的启动子下，必须在合适的诱导条件下才能表达。采用这种表达载体获得的转基因生物便于人工控制，即使进入自然环境中，由于不存在合适的诱导条件，因此不能表达外源基因产物，也不会导致环境污染和影响生态系统的平衡。可以认为这是一类较安全的基因表达载体，并且鉴于诱导表达载体能人为地控制基因时空的表达，将为基因治疗的临床应用及基础研究提供良好的手段。目前用作诱导型的启动子有二价金属离子诱导启动子、红光诱导启动子、热诱导启动子和干旱诱导启动子等。

组织特异性表达载体在较高等的真核生物中，有一类特殊的调控序列(启动子等)可以调控基因只能在一定的组织中才进行有效的表达。选用这样的调控序列可以构建一系列组织特异性表达载体，为研究动植物发育和人类基因治疗等提供了有效的手段。目前已构建的组织特异性表达载体有乳腺组织特异性表达载体、肿瘤细胞特异性表达载体、神经组织特异性表达载体、花药特异性表达载体和种子特异性表达载体等。

反义表达载体反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。此技术已成为基因治疗的重要手段，其中构建反义表达载体就可以在靶细胞内直接产生致病基因的反义RNA片段。将获得的致病基因反向组入表达载体，即可构建成反义表达载体。当反义表达载体导入靶细胞后，就可转录出与致病基因mRNA互补的反义RNA，特异性地封闭致病基因的表达。

组织特异性表达载体的构建组成型启动子控制下的外源基因在受体植物的所有组织和所有发育阶段都会表达。外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。而组织特异性启动子则能调控基因在植物特定组织和特定发育阶段表达，不仅使外源基因在植物体内发挥有效的作用，同时也可减少对植物的不利影响，因而组织特异性表达载体的构建在基因工程中具有重要的应用价值。

构建组织特异性表达载体，通常的方法就是用组织特异性启动子替换掉原有表达载体中的组成型启动子。其具体操作首先是对原有的表达载体的质粒DNA进行酶切，切除其中的组成型启动子，再与需要的组织特异性启动子连接，让组织特异性启动子连接到原有载体中组成型启动子的位置从而得到所需的特异性表达载体1。

组织特异性启动子与质粒DNA的酶切及回收1、仪器设备

(1)离心机。

(2)水浴锅。

(3)移液枪。

(4)琼脂糖凝胶电泳系统。

(5)微量分光光度计。

2、实验试剂

(1)限制性内切酶及相应缓冲液。

(2)琼脂糖、0.5×TBE缓冲液、上样缓冲液、DNA标记。

(3)DNA回收试剂盒。

3、实验步骤

(1)为了使组织特异性启动子能顺式连接到表达载体上，选取两种适当的限制性内切酶消化组织特异性启动子片段和载体。在A、B两个离心管中分别依次加入以下试剂，如图1。

(2)混匀后，瞬时离心，在37℃条件下保温3 h。在65℃条件下保温10 min灭活限制性内切酶。加入适量的上样缓冲液，混匀后离心，上样于1%的琼脂糖凝胶的两个样品槽中，并在旁边样品槽中加入DNA标记，作为酶切片段大小的参考。

3 V/cm电泳1～2 h。

(3)紫外光下对照DNA标记条带位置，选取目标条带，分别回收。按DNA回收试剂盒说明进行DNA的回收。对回收得到的组织特异性启动子DNA和载体DNA进行浓度测定。

4、操作要点

(1)取限制性内切酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短限制性内切酶在室温下的放置时间。

(2)反应混合物混匀时，应避免强烈振荡，以防止限制性内切酶变性并保证DNA大分子的完整。

(3)反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。

(4)终止酶反应可根据需要采用以下不同的方法：

①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应。

②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管在65℃条件下保温20～30 min，以灭活酶，终止反应。

③可用酚一氯仿抽提和乙醇沉淀。

组织特异性启动子与载体DNA片段的连接1、仪器设备

(1)离心机。

(2)水浴锅。

2、实验试剂

T4 DNA连接酶及其缓冲液。

3、实验步骤

(1)在1.5 mL离心管中加入以下试剂：双蒸水12 μl，组织特异性启动子片段4 μl，载体DNA 1 μl，10×连接酶缓冲液2 μl，T4 DNA连接酶(1 U/μl)1 μl。总体积20 μl。

(2)混匀后瞬时离心。

(3)在16℃条件下连接4～16 h。

(4)检测连接产物或直接用于转化。

4、操作要点

(1)连接反应中需要ATP的参与，一般在连接酶缓冲液中含有ATP，如不含ATP，则需另加ATP至终浓度为1 mmol/L。

(2)不同厂家的T4 DNA连接酶活力单位及酶反应条件(反应缓冲液、反应温度、反应时间等)不完全相同，使用时要注意2。