[科普中国]-保留特性

阴离子交换色谱柱保留特性的变化规律

选择对二甲苯氧化体系的高效液相色谱分析为研究对象，详细考察了阴离子交换色谱柱保留特性的变化，在整个色谱柱寿命期间(进样超过1000次)，全程采集了保留时间、分离度等数据。在此基础上，得出色谱柱保留特性的变化规律，并提出了相应的应对措施，把整个色谱柱寿命分成3个阶段，分别采用不同条件的流动相。

实验表明，随着进样次数的增加，色谱柱的保留特性持续发生变化，各组分的保留时间总的趋势都在减小。TA作为二元酸对离子交换色谱柱的保留特性变化最敏感，其保留时间变化最大。随着进样次数的增加，色谱柱的稳定性增加。进样约500次以后，各组分保留时间的变化明显减缓。

在色谱柱工作的各个阶段，组分间分离度的变化较为复杂，影响色谱分离的控制因素(关键组分对)也会发生变化。这主要是由于离子交换色谱体系中存在着多种电离平衡，它们共同影响着体系的色谱行为。

在离子交换色谱中，存在着3种电离平衡，分别是样品组分的电离平衡、流动相中缓冲溶液的电离平衡、柱上离子交换基团的电离平衡。色谱柱保留行为的变化、流动相组成的调整，会综合影响到上述的电离平衡，这种影响较为复杂，并不是一致的。如提高流动相的pH值，会促进流动相的电离，增加流动相的洗脱强度，减小样品组分的保留；pH值的增加同时又会促进样品的电离，增加样品组分的保留，同时还会抑制色谱柱上硅烷铵盐的电离，减小样品组分的保留。样品组分在柱上的保留时间，取决于上述3种电离平衡的综合作用。所以组分的保留时间和组分之间分离度的变化，并不是单调的。

在对二甲苯氧化体系的分析中，4一CBA和4一HMBA的分离较为特殊。不同阶段的色谱柱，对这两种物质有不同的选择性。新柱对4—HMBA保留较强，4—CBA先出峰；但是随着进样次数的增加，4一HMBA保留减弱的速度较4—CBA快，到色谱柱使用一定阶段时，它的色谱峰会跑到4—CBA的前面。这使得在色谱柱使用的某一阶段(一般在进样200次左右)，这两种物质很难分离。实验表明，通过调整缓冲溶液的浓度和流动相的pH值仍无法实现该物质对的分离。

考虑到4—HMBA的分子中含有羟基，根据相似相溶原理，采用含有羟基的甲醇代替乙腈作为流动相中的有机溶剂，并辅以缓冲溶液的调整，成功地改变了保留的选择性，4—CBA和4一HMBA达到了基线分离。采用的流动相条件：有机溶剂为甲醇10%(体积分数)，磷酸二氢铵浓度为0.20 moL/L，pH 4.31。

流动相等对蛋白质在金属螯合柱保留特性影响系统研究了流动相中盐的性质和浓度、溶液、pH以及竞争配体对蛋白质在金属螯合色谱中保留值的影响。导出了描述蛋白质在金属螯合色谱中保留特征的数学表达式，提出用洗脱强度指数ε表征盐溶液的洗脱能力。根据不同色谱条件下蛋白质的保留特性，发现蛋白质在金属螯合色谱中的保留是配位、静电和疏水的协同作用。对与蛋白质强结合的金属螯合柱，以配位作用为主，静电作用为辅；对弱结合的金属柱，以静电作用为主，配位作用为辅。在流动相中加入高浓度非成络盐，可增强蛋白质和固定相间的疏水作用。利用金属螯合配体和蛋白质间的作用力与色谱条件的相关性，对不同类型金属螯合柱可选择不同的洗脱方式。对弱结合的金属螯合柱可用低浓度盐或pH 梯度洗脱，对强结合的金属螯合柱通常用竞争洗脱剂洗脱。实验证明，NH3是一种优秀的竞争洗脱剂，它不仅效能高，而且价廉，固定金属流失少，浓度易控制。改变色谱条件可改变金属螯合配体和蛋白质间的作用力，提高金属螯合色谱的选择性2。

横向电场体积排阻电色谱中蛋白质保留特性为了强化色谱介质的孔内传质，本文研究了牛血清白蛋白（BSA）和肌红蛋白（Myo）在新设计的横向电场体积排阻电色谱柱中的保留行为，并考察了缓冲液pH、流速和电流变化周期对保留行为的影响。实验结果显示尽管Myo和BSA表观容量因子增量都随电流强度的增加而增加，但电流强度对BSA的影响更加显著。此外，缓冲液的 pH、离子强度的改变将影响蛋白质的zeta电势和/或溶液电导率，从而改变蛋白质在电色谱中的保留行为。交变电场周期也对蛋白质的保留行为有着显著的影响。最后，电色谱用以进行BSA和Myo混合物分离的尝试。实验表明，外加电场的引入可以增大BSA和Myo之间的分离度，并使其得到部分分离3。