[科普中国]-黏性质粒载体

简介

由于真核基因的结构与功能研究的需要，人们发展出比λ噬菌体载体具有更大克隆能力的新型的载体——柯斯质粒载体(cosmid vectors，cosmid是COS site—carrying plasmid的缩写)，也称为黏陛质粒或黏粒。这是一类人工构建的含有抗性基因、单一克隆位点以及λDNACOS位点(体外包装所必需)的细菌质粒。黏粒DNA和外源DNA经酶切后，需在较高浓度下连接，使两个cos位点之间有一个完整的质粒序列。当体外包装时，带有外源DNA的重组黏粒在cos位点上被切开，包装成为成熟的噬菌体颗粒。这样，噬菌体颗粒在感染菌体内重组DNA通过噬菌体的黏端而环化，并可以在宿主内自我复制，表达抗性标记。例如采用黏粒C2RB进行克隆时，首先在插入位点和两个C08基因之间切开载体，插入外源DNA，由于在两cos基因之间有一个完整的质粒序列，在体外包装成为病毒颗粒后可感染大肠杆菌，根据其抗药标志选择转化子菌落。

常用的黏粒主要有pHC79、pJB8、MUA一3、pKU206和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。pUC118与pUC119是一对相同序列的载体，但是多克隆位点区的方向相反，使外源DNA可以以正、反方向插入，它们由M13与pBR322的有关片段构建而成。

黏粒的主要特征(1)由质粒与λDNA组成的一种4～6kb的环状杂种DNA，容易分离并可离体操作。携带抗生素抗性基因为选择标记，带有pUC质粒的细菌能在含抗生素的培养基上生长。它既能像质粒一样在细菌中繁殖(pJB8、c2RB等)，有的可以在哺乳动物细胞内繁殖(pWEl5/16等)，又能像λDNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。

(2)克隆容量较大(可克隆35～45kb的基因组DNA)。采用这种大容量载体不仅可以减少构建基因组DNA文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且可以在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因。

(3)属松弛型质粒，拷贝数很多，小体积的细菌培养可收获高产量的所需DNA1。

载体技术基因表达载体的构建(即目的基因与运载体结合)是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。

将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。所谓载体，即连接目的基因、能独立于细胞染色体之外复制的DNA片段。目前，人们在基因工程中通常选用的载体有细菌质粒载体、λ噬菌体载体、柯斯质粒载体和病毒载体等。

一个理想的基因载体应该具有以下几个基本条件：①能在宿主细胞进行独立和稳定的DNA自我复制，并在其DNA中插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性；②易于从宿主细胞中分离，并进行纯化；③在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点(最好是单一酶切位点)。这些位点位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制；④具有能够观察的表型特征，在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA的选择标志。

上述基本条件主要是从原核生物DNA重组中得出的。到了真核生物阶段，由于将外源DNA引入宿主的方法有了改进，突破了原有要求重组DNA片段的大小限制．因此使得外源DNA进入宿主的能力增强了；同时．由于筛选重组体技术的改进，原来要求载体或外源DNA上有选择标记已经被杂交技术、免疫学技术等替换，从而扩大了DNA重组技术使用的范围。所以，作为载体的最基本要求有了改变，即要有自主复制能力和可利用的限制酶切点。

(1)质粒载体

质粒是小型环状DNA分子，大小为1～200kb(1kb=1000碱基对)。质粒不同于病毒，是裸露的DNA分子，没有外壳蛋白，在基因组中，也没有溶菌酶基因。质粒在宿主细胞内才能完成自身复制，同时将编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达，赋予宿主细胞一些额外的特性，包括抗性特性、代谢特性等，其中对抗生素的抗性是质粒最重要的编码特性之一。

质粒载体绝大多数是以天然质粒为基础，加以人工改造和组建。理想的细菌质粒载体，除去其他类型载体相同的特点外，还应具备以下条件：①相对分子质量尽可能小，质粒越小，拷贝数越高，而且便于提取和纯化；②DNA结构和功能清楚，质粒序列中具有包含一系列单一限制酶酶切位点的多克隆位点，便于带有不同末端的外源片段的插入；③具有在宿主中合适的一个或多个选择标记，用以筛选携带有目的片段的克隆，这类选择标记可以分为显性标记和营养缺陷型标记，最主要的显性标记是各种抗生素抗性基因(如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、阿泊拉霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等)；④缺失流动基因，这样质粒就不会从一个细菌接触转移到另一个细菌。

在基因工程中，有些载体可用于外源基因的表达等特殊用途，但一般的克隆实验可按载体的不同性质，区分为数种不同的类型。若DNA重组中克隆是要获得大量的高纯度的DNA片段，则可选用具有高拷贝数的质粒载体，如ColE1等松弛型复制子质粒；有些外源基因用高拷贝数质粒载体克隆后。其产物含量过高，会干扰寄主细胞的新陈代谢活动，对于这样的克隆基因，则最好选用由严紧型复制子PSC101派生而来的质粒载体，如PLG338、PLG339等，这些质粒的拷贝数在每个细胞只有几个，可在低水平的基因剂量下增殖克隆的外源DNA片段。

质粒克隆载体的设计和构建过程应遵循以下几条原则。

①选择合适的出发质粒

出发质粒也叫亲本质粒，它应含有质粒克隆载体必备的元件，如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。

②正确获得构建质粒克隆载体的元件

一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段，还可以采用PCR技术从靶DNA中扩增出含某种元件的特异性DNA片段。

③组装合适的选择标记基因

构建的质粒克隆载体应该组装什么样的选择标记基因，必须根据要转化的受体细胞的特性来决定。

④选择合适的启动子

为了构建表达质粒的克隆载体，必须组装合适的启动子，当设计真核生物的基因须在原核生物中表达式，常改用原核生物或病毒(噬菌体)基因的启动子，而原核生物基因在真核细胞中表达时，仍可用原核生物基因的启动子。

由于质粒载体可用于简便、快速、大量地制备某些克隆的DNA片段，多年来被广泛采用并改进，产生了更多更有用的质粒载体，如PBR322、PUC系列、PSP系列、BluescriptM等。这些载体多已商品化。可以直接购买。

(2)病毒和噬菌体载体

病毒主要有DNA(或RNA)和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的合成系统进行DNA(或RNA)复制和壳蛋白的合成，实现病毒颗粒的增殖。把感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的克隆载体则称为噬菌体克隆载体。

噬菌体作为载体，可插入长10～20kb甚至更大的一些外源DNA片段，又由于噬菌体有较高的增殖能力，有利于目的基因的扩增，从而成为当前基因工程研究的重要载体之一。

野生型的噬菌体必须经过改造，才能成为比较理想的基因工程载体。噬菌体中首先被改造成为载体的是λ噬菌体，此外还有单链噬菌体载体、黏性质粒载体等。λ噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链黏末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖：溶菌性方式(lytic pathway)和溶源性方式(lysogenic pathway)。λ噬菌体含有线性双链DNA分子，其长度为48502bp。两段各有由12个核苷酸组成的5’端凸出的互补黏性末端，当λDNA进入宿主细胞后，互补黏性末端连接成环状DNA分子，连接处称为cos位点。

构建λ噬菌体载体的基本途径如下：①抹去某种限制性内切酶在λDNA分子上的一些识别序列，只在非必需区保留1～2个识别序列；②用合适的限制性内切酶切去部分非必需区，但是由此构建的λDNA载体不应小于38kb；③在λDNA分子的合适区域插入可供选择的标记基因。值得指出的是，没有适用于克隆所有DNA片段的万能λ噬菌体载体，必须根据据需要选择合适的噬菌体载体2。

(3)人工染色体克隆载体

人工染色体克隆载体实际上是一种穿梭克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制，在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞。

可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递，筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。与其他克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。

常见的人工染色体克隆载体主要有酵母人工染色体、细菌人工染色体载体和P1人工染色体载体等。

酵母人工染色载体(YAC)是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90min。YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒(TEL)。YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trpl、leu2涩和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3以及赭石突变抑制基因sup4等。与YAC载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2一1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2一1基因的突变效应，形成正常的白色菌落3。

利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。

细菌人工染色体载体(BAC)是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子(致育因子)的严谨型控制的复制子oriS，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶。BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。新型的BAC载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆DNA的Not工酶切位点和用于克隆DNA测序的Sp6启动子、T7启动子。Not Ⅰ识别序列，位点十分稀少。重组子通过Not Ⅰ消化后，可以得到完整的插入片段。Sp6、T7是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序4。

P1人工染色体载体(PAC)结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB及噬菌体P1的质粒复制子和裂解性复制子。然而除了将连接产物包装进λ噬菌体颗粒以及在cre—loxP位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组PAC也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持。基于PAC的人类基因组文库插入片段的大小在60～150kb之间。