[科普中国]-羰基二咪唑法

人工抗原制备方法

根据免疫学的原理，好的抗原能够刺激机体产生特异性高的抗体。但是作为小分子物质，其分子质量一般低于1000，很难像大分子蛋白质那样有效激活机体的免疫系统产生抗体。因此小分子物质只具有产生免疫反应性，但缺乏免疫原性，将这种小分子物质称之为半抗原。但是大分子蛋白质，例如常用的偶联载体BSA、OVA、KLH、HAS等，这些蛋白质分子质量都大于30kD，当把半抗原通过适当的偶联方法连接到这些载体蛋白上，然后用这些载体蛋白和小分子的偶联物进行免疫时，免疫动物就会有效的产生免疫反应，从而产生针对小分子半抗原的抗体。另外，在检测的时候，小分子物质也不能有效的被固相载体吸附，因此也必须通过偶联载体的形式吸附与固相载体上，便于检测1。

目前，人工制备小分子完全抗原的方法很多，具体采用哪种方法进行偶联，还需要根据小分子物质自身的分子结构，以及偶联载体所具有的活性基团来进行制备。现在偶联方法主要包括：混合酸酐法、戊二酸酐法、戊二醛法、碳二亚胺法、活泼酯法、羧甲基羟胺法、过碘酸氧化法、1,4-丁二醚法、对氨基苯甲酸法等。其中混合酸酐法经常被用于那些含有游离羧基的小分子半抗原与载体蛋白上游离的氨基，碳二亚胺法主要适用于含有氨基的小分子物质与所及化合物的偶联，重氮化法主要用于小分子苯环上含有氨基的偶联，过碘酸氧化法主要用于一些小分子物质中含有糖环化的偶联，羧甲基羟胺法主要用于小分子含有的酮基的偶联，活泼酯法是直接将N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为活化剂，以环二己基碳酰亚胺（DCC）为脱水机不经过偶联桥直接将小分子物质连接到载体蛋白上，这种方法也被证明产生副产物少和抗体特异性强。

小分子上与蛋白连接基团的选择对所产生抗体的特异性的影响小分子为具有多种反应基团如氨基、羧基、醛基等的物质，这些基团既是其区别于与其相近似分子的特异性抗原决定簇之所在，也是其用于与蛋白分子的交联的结合基团。因此，当这些基团与蛋白大分子结合后，再免疫动物所得到的抗体，往往特异性会有所降低，尤其是分子结构上相近似的小分子，如选用每种小分子物质特有基团连接蛋白，则免疫动物后所得抗体的特异性就差，因为其特异的抗原决定簇在刺激动物机体抗体的生成中不起作用，而共同的基团所组成的抗原决定簇却不受影响，激发机体的免疫应答而产生能结合具有此决定簇的所有近似小分子的抗体。因此，选择相关小分子均有基团用于与蛋白分子的交联，得到的抗体具有较好的特异性。此外，在小分子与载体蛋白之间加入一连接空间臂，也能改善所得抗体的特异性。

N'N-羰基二咪唑法制备RAC人工抗原利用N'N-羰基二咪唑将莱克多巴胺（RAC，Ractopamine））上的羟基直接与载体蛋白上的羧基偶联制备RAC人工抗原，通过鉴定结果可以看出此方法初步可行。N'N-羰基二咪唑法制备人工抗原的过程中，由于偶联形成的是酯键，不如肽键稳定，因此抗原的稳定性和溶剂对抗原制备效果的影响还需要进一步研究。

制备方法①在干燥条件下用万分之一分析天平称取17mg（约50μmol）RAC，溶于2.5mL分析纯的四氢呋喃溶液或无水吡啶溶液，使其充分溶解。

②加入20mgCDI，于37℃条件下120r/min搅拌反应1小时，然后用氮气吹干四氢呋喃。

③在干燥条件下称取25mgBSA，溶于3mLpH7.2的PBS缓冲溶液中，使其充分溶解。

④将步骤2得到的产物用300µLDMF充分溶解后逐滴加入到配好的BSA溶液中，在室温条件下搅拌反应4小时，转速为120r/min。

⑤收集反应液，转移到处理好的透析袋中，然后放入PBS缓冲液中，4℃条件下透析3天，每经过6-8个小时用预冷的新鲜PBS进行换液。

⑥透析结束后，收集透析后的产物转入离心管中，5000r/min条件下离心10分钟，收集上清，分装后于-20℃条件下冻存备用。

抗原的鉴定对N'N-羰基二咪唑法制备的RAC人工抗原分别进行浓度测定、紫外光谱扫描鉴定、SDS-PAGE凝胶电泳鉴定和免疫原性鉴定。

抗原鉴定结果紫外光谱扫描鉴定结果

载体蛋白BSA在279nm有最大吸收峰，RAC在274nm处有最大吸收峰。采用N'N-羰基二咪唑法制备RAC-BSA人工抗原的最大吸收峰在278nm处，较载体BSA的最大吸收峰279nm有蓝移现象，与相关文献报道一致，可以说明通过N'N-羰基二咪唑法能够将RAC与载体蛋白偶联，从而制备RAC的人工抗原。

SDS-PAGE鉴定结果

根据BSA的分子质量，其条带出现在65kD处，而人工抗原RAC-BSA与载体蛋白BSA相比，由于载体BSA上偶联有RAC分子，分子质量有所增加，出现滞后现象，与混合酸酐法相比，两种方法制备的抗原都出现了不同程度的拖尾现象，再次证明通过N'N-羰基二咪唑法可以将载体BSA与RAC分子进行偶联。

效价测定结果

从效价结果可知，当把N'N-羰基二咪唑法制备的RAC-BSA作为免疫原免疫Balb/c小鼠，把Linker法制备的RAC-OVA作为包被原用于ELISA检测小鼠血清效价，免疫两只小鼠效价平均值测得小鼠的效价达到1：6400，从效价结果可知，N'N-羰基二咪唑法制备的RAC-BSA产生抗血清效价较1,4-丁二醚法和混合酸酐法低，原因可能是CDI法制备RAC人工抗原过程中偶联效率不高造成的2。