[科普中国]-病毒测定培养-

病毒的测定

样品中的病毒数量可用颗粒计数法、间接计数法或感染效价法进行测定。

（1）病毒颗粒计数法

病毒颗粒计数法可直接用电子显微镜计数。它通常被用于已知形态病毒的浓缩样品的计数。其测定方法是将病毒样品与已知浓度的乳胶小颗粒均匀混合，然后将混合液均匀喷洒在已包被的样品方格网上，分别计乳胶颗粒和病毒颗粒数目。病毒的浓度可由样品中两种颗粒的比例和乳胶颗粒浓度计算得出。

（2）间接计数法

用血细胞凝集试验计数是分别将红细胞与一系列10倍稀释的病毒样品混合，再观察结果。以能引起血细胞凝集的最高稀释倍数（或稀释倍数的倒数）为病毒的效价。

（3）病毒感染效价测定法

病毒（噬菌体）感染效价测定法与以下的病毒培养方法基本相同。

病毒的培养特征（1）病毒在液体培养基中的培养特征

将噬菌体的敏感细菌接种在液体培养基中，经培养后敏感细菌均匀分布在培养基中而使培养基浑浊。然后接种噬菌体，敏感细菌被噬菌体感染后发生菌体裂解，原来浑浊的细菌悬液变成透明的裂解溶液。

（2）病毒在固体培养基上的培养特征

将噬菌体的敏感细菌接种在琼脂固体培养基上生长形成许多个菌落，当接种稀释适度的噬菌体悬液后引起点性感染，在感染点上进行反复的感染过程，宿主细菌菌落就一个个地被裂解成一个个空斑，这些空斑就叫噬菌斑。

病毒的培养基病毒是专性寄生在活的敏感宿主细胞内才能生长繁殖的超微生物。因此，病毒的培养基要求苛刻，专一性强。其敏感细胞要具备如下条件：① 必须是活的敏感动物或是活的敏感动物组织细胞；② 能提供病毒附着的受体；③ 敏感细胞内没有破坏特异性病毒的限制性核酸内切酶，病毒进入细胞可生长繁殖。

不同种类的病毒其培养基是不同的。

脊椎动物病毒的培养基有：① 人胚组织细胞（如人胚肾、肌肉、皮肤、肝、肺、肠等器官的细胞）；② 人组织细胞（如扁桃体、胎盘、羊膜、绒毛膜等）；③ 人肿瘤细胞（如Hela细胞、Hep-2细胞、上皮癌细胞等）；④ 动物组织细胞（如猴肾和心脏、兔肾、猪肾细胞等）；⑤ 鸡、鸭胚细胞（如肌皮和全胚细胞）；⑥ 敏感动物（如猴、兔、羊、马、小白鼠、豚鼠等），脑炎病毒最宜选用幼龄小白鼠作敏感动物。

植物病毒的培养基：与植物病毒相应的敏感植株和敏感的植物组织。

噬菌体的培养基：与噬菌体相应的敏感细菌，如大肠杆菌噬菌体用大肠杆菌培养。

病毒的培养动物病毒的培养动物病毒的培养方法有动物接种、鸡胚接种和组织培养技术。现在动物接种很少用，仅柯萨奇A病毒组（肠病毒）的分离仍用此法。鸡胚常用于分离流感病毒，鸡胚的羊膜腔和尿囊腔用作常规注射部位，如痘病毒被注射入绒毛尿囊膜上，以呈现在尿囊膜表面的痘斑或痘疱进行计数。现在，组织培养技术已广泛应用，下面略作介绍。

（1）动物病毒的空斑试验

① 单层细胞的制备和培养：用无菌小刀将动物组织切成0.5～1 mm的小块，用平衡盐溶液（Hank’s或Earle’s）洗涤数次，加体积分数5%胰酶消化10～15 min（有的消化时间长至30 min，甚至十几小时），将细胞间的“间质蛋白”水解，使细胞分散，将胰酶冲洗掉，吹散细胞并计数。加入含牛血清的生长液，分装，保持37 ℃温度，培养2～3 d即长成单层细胞，以备培养病毒用。还可经传代后再培养病毒。

② 病毒样品的采集与制备：病毒存在于动、植物病灶的组织、体液、分泌物、粪便、下水污泥、活性污泥、污水、河水、湖水、海水等处。病毒样品有三种状态，它们的采集和制备有所不同。固体病毒样品采得后，加液体培养基制成悬液，以10000 r/min离心10 min，去杂质，取其上清液备用。液体病毒样品则直接以10000 r/min离心10 min，去杂质，取其上清液备用。空气病毒样品采用真空泵抽取至长有宿主菌的平板上，或是将长有宿主菌的平板打开盖，在空气中暴露30～60 min以收集。若样品中病毒浓度大则要适当稀释，若样品中的病毒浓度小则要浓缩。

③ 动物病毒的接种与观察：将病毒悬液置于单层细胞的表面，经适当时间孵育，使病毒最大限度地吸附在宿主细胞上。再将软琼脂或羧甲基纤维素注入铺在单层细胞表面，再经一定时间培养，结果在单层细胞上呈现出空斑。以出现的空斑数判断病毒数。

所谓空斑是指原代或传代单层细胞被病毒感染后，一个个细胞被病毒蚀空成空斑（亦称蚀斑）。一个空斑表示一个病毒。所以，通过病毒空斑单位的计数可知单位体积中含有的病毒数。1

（2）系列稀释终点

首先将病毒稀释成一系列稀释悬液，将病毒系列稀释液接种到含宿主细胞的培养管中（三管至五管法），或接种到敏感的动物体内，经适当的温度培养后，借助显微镜观察细胞形态的改变（细胞病理效应CPE），并观察培养管的变化，由浑浊转变至清。还可观察感染动物出现死亡、瘫痪或其他病变。记下每个系列稀释液阳性样品的百分率和病毒的稀释度，作图可得到病毒的滴度或终点。

所渭病毒的滴度是：指能产生培养管中的50%CPE（细胞病理效应）的最高病毒稀释度（即最少的病毒量），称为TCLD50。（组织培养感染剂量）。若是敏感动物则用ID50（使50%的敏感动物发生变化的感染剂量），或LD50。（引起50%敏感动物死亡的致死剂量）表示病毒的滴度。

噬菌体的分离培养用双层琼脂法培养，在实验的前一天在灭菌的培养皿内倒入10 mL适合某种宿主菌生长的琼脂培养基，待凝固成平板后置于一定温度的恒温箱内烘干平板上的水分，取2～3滴宿主菌（每mL含10个细菌）于软琼脂培养基（融化并冷至45 ℃）中，再加入0.1 mL噬菌体样品，摇动混匀后全部倒入，使铺满整个琼脂平板上，凝固后，于一定温度的恒温箱中倒置培养一定时间后，取出计数。2