[科普中国]-三磷酸腺苷生物发光法

三磷酸腺苷的理化性质

（三磷酸腺苷又称腺苷三磷酸）是高能磷酸化合物的典型代表。ATP是由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成的核苷酸。ATP有两个高能磷酸键，一个低能磷酸键。每个高能磷酸键水解时，可产生30.54kJ/mol的能量。ATP是细胞内特殊的自由能载体，广泛地存在于细胞内，如细胞核、细胞溶胶、线粒体等。易水解，且水解时可释放出大量的能量，但水解易受细胞内环境的PH、Mg2+浓度等的影响。ATP在生命活动中起着传递能量的作用。

ATP生物发光法检测的原理及一般步骤ATP普遍存在于所有活的生物体中，被用来贮存和传递化学能，称作为“能量货币”。当生物体死亡后，在细胞内酶的作用下，ATP很快被分解掉。因此，测定样品中的ATP浓度，即可推算出活菌数。

ATP生物发光技术产生于20世纪70年代中期。1983年，Moycr等最早提出细胞内源性ATP的含量可以反映细胞的活性和活细胞的数量。同年，Gronroos等也证实该技术是一种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检测方法。McElroy最先引入荧光素酶ATP检测法。

根据文献报道，每个细胞内的ATP含量大致是一定的，则由此可以推算出细菌数量。但由于实际检测中除了含有细菌外，还含有酵母等其他微生物，而酵母菌中ATP的含量通常是细菌中ATP含量的100倍左右。因此，若同时又换算成酵母菌的活菌数量，则样品中活菌数应介于二者之间。

此外，曾有学者以生物量C/ATP来推算生物量。Karl等研究了浮游植物的生物量与ATP含量之间的关系，发现单细胞微生物的生物量C/ATP的平均比值为250，而多细胞有机物的生物量C/ATP则小于100。还有学者预计通过测定ATP/CFU的大小来预测样品中所含菌种类别，若ATP/CFU较小，则样品中可能主要含有形态较小的G－细菌或孢子；若ATP/CFU较大，则样品中可能主要含有酵母菌或形态较大的G+细菌。

ATP生物发光法的检测步骤大体包括：取样、样品ATP萃取、添加荧光素-荧光素酶、测定生物发光量、求出ATP浓度和活菌数。通常，样品未经处理是不能测定ATP的。测定时需先将样品与ATP提取剂混合，使细胞膜和细胞壁溶解，释放出ATP。ATP提取剂是以表面活性剂为基质的专用试剂。然后，提取出的ATP再与荧光素-荧光素酶生物发光剂作用，用发光检测仪测定ATP与发光剂反应的生物发光量。通过预先测定的ATP标准曲线，得出活菌的总ATP量，即可得出细菌总数1。

ATP生物发光法应用范围ATP生物发光法的应用范围十分广泛，现已应用于食品工业的众多领域。例如，用生物发光法测定肉类食品中细菌污染情况。研究表明，ATP生物发光法与标准的细菌培养菌落计数法相比，二者具有良好的相性(r=0.98)。此外，ATP生物发光法还可用于乳制品中乳酸菌的测定、啤酒中菌落总数测定、调味品及脱水蔬菜的细菌学测定等。实验表明，ATP生物发光法与传统的琼脂平板法均具有高度的相关性。食品生产环境的清洁度检测是HACCP的重要内容。HACCP是指在食品生产和流通的整个过程中，对可能发生危害食品安全之处进行分析，确定出应重点进行卫生管理之处，并在此处设定卫生管理标准，经常进行监测，记录下检测结果，以防止危害健康的事件发生。以往食品生产环境的清洁度管理多采用棉拭取样与平板培养法共用的方法来检测表面附着的微生物，这样就使得检测时间长、检测结果滞后，因而不能满足HACCP管理系统的要求。而食物残渣是食品生产环境的主要污染物质，且各种食品中均含有ATP，ATP耐热性较强。因此，采用ATP生物发光法可快速、简便地检测出食品生产环境的清洁度。这样，ATP生物发光法就十分适合HACCP系统的清洁度检测。例如，用ATP生物发光法检测食品生产线及厨房、冰箱、食品操纵台、铁路站车食品器具等处的清洁度。许多研究表明，这种方法与琼脂培养法相关性高、可行有效。此外，还可以用于酵母菌等对毒素的敏感性比较。现今已出现ATP生物发光法与其它快速检测方法并用的情况，如ATP生物发光法与PNA探针技术合用等2。