[科普中国]-疏水吸附

简介

疏水吸附层析是70年代兴起的一种新技术。它对蛋白质混合物有很好的分离效果。目前，这一技术已广泛地用于蛋白质及其它生物大分子的分离纯化。

在亲和层析载体的发展中，发现某些蛋白质即使不存在带电末端(氨基或羧基)也能与1，6-亚己基间隔臂发生强烈的连接，这是由于在吸附剂上的脂肪族长链和生物分子表面上疏水区相互作用的结果，该发现使疏水层析技术得到了很好的应用。

基本原理疏水吸附层析的基本材料是疏水吸附剂。疏水吸附剂是由球状的载体与疏水基团共价结合而成的。在疏水吸附剂颗粒的表面上，分布着许多的疏水基团。在球状蛋白质分子的表面上，有疏水区和疏水口袋。它是由一些疏水氨基酸残基的疏水基团构成的。将悬浮于吸附缓冲液的疏水吸附剂装进层析柱内，构成柱床，然后，将溶于吸附缓冲液的样品(蛋白质混合物，含目的蛋白质)加入柱床。在吸附条件下，由于疏水吸附剂的疏水基团与蛋白质分子的疏水基团之间的疏水相互作用，因而，使蛋白质吸附在吸附剂的表面上。然后，改变洗脱条件，减弱疏水相互作用，从而使蛋白质从吸附剂上解吸下来。影响疏水相互作用的因素有两个：一是蛋白质的疏水性。不同蛋白质的疏水区和疏水口袋，在数目、大小、形状和亲脂性上各不相同，因而与吸附剂的吸附力有差异。二是蛋白质的环境。在水相中提高中性盐的浓度或降低乙二醇的浓度，可以增强疏水基团间相互作用力，反之，则减弱这种作用力。疏水层析，就是通过对疏水相互作用强弱的调控，来达到分离纯化蛋白质的目的。

疏水吸附剂疏水作用吸附需要使用疏水作用的吸附剂，它与其他吸附技术所用的吸附剂相类似，由作为骨架的基质和键合在基质上参与疏水作用的配基组成。

①基质可分为“软基质”，其中以琼脂糖使用最广泛，另外还有葡聚糖、高分子聚合物和纤维素等；“硬基质”主要是大孔径硅胶。琼脂糖一类凝胶的优点是亲水性强，表面羟基密度非常大，衍生化后可产生取代程度和结合容量较大的吸附剂，其大孔结构适合于大分子蛋白质的分离，且pH值稳定性良好。硅胶的特点是硬度大，机械稳定性高，但其表面可供衍生的基团少，且仅在pH值2～8范围内稳定，因此其应用受到限制。但后来采用了聚合物包裹技术，在硅胶或其他有机聚合物表面包裹一层带有可衍生基团的高分子材料，从而克服了上述缺点，使其具备良好的分离性能，得到了广泛的使用。

②疏水性配基主要有苯基、短链烷基(C3～C8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性配基与亲水性基质之间的偶联主要利用氨基的结合或醚键结合来实现。疏水吸附剂作用与其他吸附剂不同，它们对组分的分离要比在相同情况下的离子交换色谱要好。其优点是对蛋白质的吸附容量较大(10～100mg/cm)，并可重复使用，效果不变，但其使用有局限性，所能达到的分辨率也不高。

疏水层析的条件① 对疏水吸附剂的选择根据样品特点和实验目的选择合适的疏水吸附剂。用一组柱，如Seph-Cn(n=1-10)，层析样品，看样品的吸附情况。随着碳链的增长，蛋白质吸附量也增加，但洗脱条件亦随之变得剧烈。要选择能完全吸附目的蛋白质，但洗脱条件又比较温和的疏水晒附剂。

② 对吸附条件的选择为了使目的蛋白质能紧密地结合在柱床上，要选择合适的缓冲浓离子强度和pH。上柱的样品溶液应含有一定浓度的中性盐，以增加目的蛋白质与疏水吸附剂的疏水相互作用。一般要在较高的离子强度(4mol/L NaCl)下吸附目的蛋白质。

③ 对洗脱条件的选择用适当的洗脱缓冲液可以将不同的蛋白质从吸附剂上先后洗脱下来。有各种洗脱方法：降低缓冲液的离子强度；增加缓冲液的pH；加乙二醇降低洗脱液的极性；在洗脱液中加去污剂；改用低盐析效应的盐。上述洗脱方法，有的直接破坏疏水相互作用；有的通过改变蛋白质构象起作用。通常，用由高到低的NaCl浓度梯度洗脱，或者，由高到低的盐浓度梯度加上由低到高的乙二醇浓度梯度洗脱。2

疏水吸附的应用某些低水溶性的蛋白质，如球蛋白、膜缔合蛋白和其他一些在20%～40%硫酸铵饱和度时能沉淀的蛋白质，在低盐浓度时。能被疏水吸附剂强烈地吸附，但是可以通过降低温度、加入有机溶剂、加人多元醇(特别是1，2-乙二醇)、加入非离子洗涤剂、增加离液序列高的离子(例如硫氰酸盐)、改变pH值等方法来削弱疏水区的相互作用，使蛋白质从吸附剂上洗脱下来。

同样，C4、C8、C18(脂肪链)和苯基取代的高效液相色谱(HPLC)柱，用于纯化多肽和蛋白质，也是建立在疏水吸附理论基础上的。

这种技术已成功地用于多种酶的分离纯化上，例如，用癸基或辛基的琼脂糖柱吸附，然后用1，2-乙二醇梯度洗脱从人胎盘中分离纯化葡糖脑苷脂-伊葡糖苷酶；用苯基琼脂糖凝胶柱吸附和pH 7.6的Tris-HCI溶液递减梯度洗脱的办法分离纯化由荧光假单胞菌产生的芳香酰基酰胺酶。3