[科普中国]-耦合固定化

固定化技术经过三十多年的发展，克服了游离酶反应存在的分离困难、稳定性差和易流失等问题。但真正应用于工业化的固定化酶并不多，主要是因为固定化酶的过程中还存在几个急待解决的难题:(1)酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低；(2)酶固定化后多了空间屏障，增加了传质阻力；(3)酶和载体结合不牢固，容易脱落，酶活力损失大；(4)固定化颗粒成型困难。如何解决这些问题是固定化技术的热点，研究者不断地对固定化载体改良并提出新的载体和固定化方法，并在耦合固定化方面进行了大量的研究。

耦合固定化耦合固定化是指几种固定化方法或载体的联合使用，即添加稳定因子和促进因子的固定化方法。近年来耦合固定化技术发展迅速，在生物转化、手性拆分和废水处理等方面均有良好的应用实例。耦合固定化技术能够平衡传统单一固定化方法的优缺点，使酶在保持原有活性的基础上，稳定性有所提高，还具有操作简单、成本低廉等优点。对几种主要的耦合固定化技术进行简单地介绍：

耦合固定化技术吸附-交联吸附载体富含氨基或羟基，酶通过物理吸附或离子吸附作用与载体结合，结合力比较弱，高离子强度和高pH值下，容易解析造成酶的泄漏，一般不单独使用。吸附-交联法是目前使用较多的耦合方法，其中以先吸附后交联的方法最为常见。交联作用能够增强酶和载体之间的作用力，避免单一吸附固定化酶易脱落造成产物污染的缺点，提高固定化酶的稳定性。JyotiLIyer等发现用纯化的海沙固定环胡精葡萄糖苷转移酶(CGTase)，虽然能够达到98%的吸附率，但酶很容易从介质上脱落，而戊二醛的交联增强了结合力，解决了这个问题，酶反应8批次后，仍然能够维持80%的活性。VemuriG等研究发现蛋壳吸附，戊二醛交联固定化脂肪酶的方法机械强度好，能够抵挡较强的剪切力，比海藻酸包埋法更适合于催化搅拌罐中的油脂反应，能重复使用8批次。吸附介质和一些添加剂对酶有保护作用，能够降低交联的激烈程度。辛嘉英等以Al2O3为载体，在明胶的保护作用下，通过吸附交联法固定化葡萄糖异构酶，酶活力由62.3%提高到92.6%，这是因为明胶中富含氨基基团，能替代酶表面的氨基和戊二醛的活性基团相互作用，缓解交联的激烈程度。吸附-交联法还具有操作简单、吸附容量大、材料来源广泛等优点。SouzaSFD等研究了一种用棉布做固定化载体的简单技术，酶吸附在表面覆盖有聚丙稀酰氨的棉布上，戊二醛交联后即得到连续使用的固定化酶。邱广亮等研究了磁性载体的吸附-交联法固定酶的方法，磁性载体具有两亲性，适用于水相和有机相系统，并可通过简单的磁场作用力实现酶的回收。戊二醛交联增强了磁性载体的耐热、酸、碱性，同时存储稳定性和操作稳定性也有所增强。

共价结合-交联共价结合法一般通过载体表面的基团与酶表面的基团如:氨基、羧基、巯基等相互作用实现固定化，结合比较牢固，基团之间有很强的选择性。共价结合-交联法能增强酶和载体间的作用力，并且通过交联作用使载体结合更多的酶。ParkSeungWon等将GL-7ACA酰基转移酶通过共价结合-交联法固定在3-氨基丙烷基三乙氧基硅烷活化的硅胶上，酶活力可提高60%，反应20批后酶活力仍维持在70%以上。HungTien-Chieh等介绍了以壳聚糖为载体固定化脂肪酶的方法，首先用碳化二亚胺激活壳聚糖上的羟基，使酶共价结合到羟基上，再通过戊二醛在壳聚糖的氨基上交联更多的酶，该固定化方法又称“二元固定化法”。共价结合-交联法也存在一些缺点，如操作比较复杂，需要对载体进行修饰和活化，酶和载体结合过程中反应激烈，容易造成酶失活。LeontievskyAA等在研究中发现，用共价结合-交联法固定化漆酶，虽然能够维持原有酶活力33天，但造成的酶活力损失可达50%1。

絮凝固定化与其他方法的耦合1977年，LongMargarete等提出絮凝固定化技术，用絮凝剂对细胞进行处理，将得到的絮团经离心、过滤、压缩、干燥等工艺，得到粒径统一的固定化细胞颗粒。絮凝固定化具有条件温和，酶活回收率高的优点，单一絮凝固定化的方法避免了将细胞从发酵液中分离的步骤，但操作过程也很复杂。如果用絮凝-吸附法将从发酵液(酶液)絮凝出的酶直接吸附到介质上，可简化絮凝固定化的操作工序，并增加固定化酶的稳定性。NiveditaKamath等利用多聚电介质的絮凝能力将尿素降解细胞吸附在棉布介质上降解尿素，大大降低了传统高压分解釜分解尿素的费用，并适用于连续的操作。絮凝-包埋法的耦合能够较好地解决絮凝固定化方法，但机械强度不好，酶在包埋介质中容易发生泄露。肖厚容等采用絮凝-包埋-交联的方法，以脱乙酰壳聚糖为载体，明胶包埋，戊二醛为交联剂，对胰蛋白酶进行了固定化处理，兼有絮凝固定化方法的快速方便，包埋法的成型容易和交联强度大等优点。黎刚采用絮凝-PAM包埋的方法得到了活性较高的固定化微生物，絮凝剂的加入还起到保护细胞的作用，降低了PAM造成的酶活损失。

絮凝-交联、絮凝-微囊法能够有效地提高固定化载体的机械强度。LanteroJr等研究采用多聚电解质絮凝，戊二醛交联耦合法固定化红色精朊杆菌(protaminobacterruber)生产异麦芽酮糖。Cantwell等用絮凝-微囊法将含酶的假单孢菌(PeseudomonasPutida)、絮凝剂聚丙稀酰胺和丙稀丁二稀乳胶按2∶1∶1的比例混合，搅拌后可得具有较高机械强度的聚合微囊，其化学稳定性和生物稳定性都很好。

包埋固定化与其他方法的耦合包埋法是固定化酶比较方便的方法，条件温和，基本上不会改变酶的结构，细胞也不容易脱落，但主要存在机械强度差、酶易泄漏和传质阻力较大。耦合固定化技术能够很好地解决这两个问题。包埋法使用的一些凝胶分子间隙较大，即使是分子量很大的酶也容易在其中发生疏漏，解决这个问题主要有两个方法:一是用交联或共价结合的方法处理包埋酶颗粒；二是将酶吸附在一些大分子颗粒上，增大酶分子的体积。BoadiDK等发现用包埋-交联法固定单宁酸酶，能有效地提高酶活保留率。TanrisevenAziz等将葡萄糖淀粉酶吸附在凝胶化的玉米淀粉颗粒上，再用海藻糖包埋，解决了酶泄漏的问题。一些凝胶，如海藻酸钙在含有磷酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐以及钠离、镁离子的溶液中不稳定，能够和钙离子发生离子交换作用，导致胶体的膨胀。而用一种富含阳离子的物质和凝胶的酸根相互作用，能够在载体表面形成保护膜，有利于包埋酶的稳定。海藻酸钙-壳聚糖微胶囊具有较好的稳定性和渗透性。王康等用海藻酸钠和壳聚糖固定化脂肪酶，将其应用于有机相的反应，提高固定化酶的包埋率和稳定性，并且由于壳聚糖具有一定的疏水特性，这有利于疏水底物向酶分子周围的扩散2。

从较早的吸附-交联法、包埋交联法开始，耦合固定化技术已经得到越来越多的应用，先后提出并研究了包埋-吸附法、絮凝-吸附法、吸附-交联法、膜-吸附法等方法。耦合技术为传统的固定化方法注入了新的特点和活力，使固定化技术的应用前景更加广阔。耦合固定化基本上能够解决单一固定化方法酶活回收率低、稳定性差、传质阻力差等问题，并具有方法多样、操作简便、技术成熟等特点。随着人们对固定化酶微环境认识和研究的进一步加深，耦合固定化技术将逐步成为研究的热点。