[科普中国]-发酵剂菌种

发酵剂菌种分类

在干酪和其他发酵乳制品的加工中，采用的发酵剂菌种主要包括细菌、酵母菌、霉菌以及它们的组合形式。下面对参与乳制品发酵的相关微生物菌种的特点做一介绍。

一、链球菌属

链球菌属中惟一应用于乳品发酵的菌种是嗜热链球菌。与其他链球菌不同，嗜热链球菌有较高的抗热性，能在52℃下生长，能仅仅发酵有限种类的碳水化合物进行同型乳酸发酵。多数需要在高温下(>40℃)发酵的乳制品其酸化过程均来源于嗜热链球菌和乳杆菌的联合生长作用。通常，尽管嗜热链球菌拥有不同类型的蛋白水解酶，但其水解蛋白的能力较弱。

二、乳球菌属

乳球菌以前属于N组链球菌，是主要的用于乳品发酵中进行酸化的嗜温型微生物。乳球菌细胞呈球形或卵圆形，单生、成对或成链状。革兰氏染色阳性，兼性厌氧，不运动。所有的乳球菌通常能在4%的NaCl溶液中生长。同型乳酸发酵，当接种到乳中后，约95%的最终产物是L型乳酸。乳球菌可以在10℃生长，但不能在45℃的条件下生长。它们的水解蛋白活力较弱，可以利用乳蛋白。借助细胞外蛋白酶的作用，乳球菌能水解牛乳中的酪蛋白。尽管乳球菌属有5个种，但乳酸乳球菌种在乳品发酵中意义最重要。乳酸乳球菌有2个亚种：一个是乳酸乳球菌乳酸亚种；另一个是乳酸乳球菌乳脂亚种。与乳酸乳球菌乳脂亚种相比，乳酸乳球菌乳酸亚种有更高的耐盐性和耐热性。乳酸乳球菌乳酸亚种的一个变种是丁二酮乳酸球菌。丁二酮乳酸球菌能利用柠檬酸代谢生成丁二酮、C02和其他物质，赋予发酵乳品特殊的风味。部分乳酸球菌菌株也产生胞外多糖，常常被用来生产具有极为黏稠特性的斯堪地那维亚发酵乳制品，如维力、Taettamilk和Langmjolk等。

三、明串珠菌属

与其他的乳酸菌相比，明串珠菌是独特的，属于乳酸异型发酵的嗜温型球菌。明串珠菌细胞呈球形，尤其是生长在琼脂培养基上时，通常呈豆状。细胞成对或链型排列，革兰氏阳性，不运动，不形成芽孢，兼性厌氧。明串珠菌不能水解精氨酸，需要不同的B族维生素才能生长。应用于乳品生产的明串珠菌能利用柠檬酸代谢生成丁二酮、CO2、3一羟基丁酮等。某些菌株也能够利用蔗糖产生葡聚糖。仅有2个明串珠菌种可以作为乳品发酵剂，一个是肠膜明串珠菌乳脂亚种，另一个是乳酸明串珠菌。因明串珠菌缺乏足够的水解蛋白能力，通常它在乳中的生长能力非常差。尽管肠膜明串珠菌乳脂亚种在乳中无法产生足够的乳酸而使乳凝固，但乳酸明串珠菌却可以使乳凝固。作为发酵剂，明串珠菌常常是与乳酸球菌搭配。除使乳酸化外，二者的搭配可以产生足够量的丁二酮和C02，赋予发酵乳品特殊的香味。

四、乳杆菌属

乳杆菌是一类由遗传和生理特性多样的杆状乳酸菌构成的菌属。基于发酵的最终产物，这个属的种可以被划分到3组，即同型乳酸发酵的乳杆菌、兼性异型乳酸发酵的乳杆菌和专性异型乳酸发酵的乳杆菌。同型乳酸发酵的乳杆菌通过糖酵解途径可以完全发酵己糖到乳酸，它们不能发酵戊糖和葡萄糖酸。常见于乳品发酵剂中的这类乳杆菌有：德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种和瑞士乳杆菌等。与其他两组的乳杆菌相比，它们能在高温(>45℃)条件下生长，属于嗜热型的微生物。这一组的另一个种是嗜酸乳杆菌。兼性的异型乳酸发酵的乳杆菌要么仅仅发酵己糖到乳酸，要么当介质中葡萄糖含量有限时，发酵己糖到乳酸、乙酸、乙醇和甲酸等物质。借助磷酸转酮酶途径，这类乳杆菌可以发酵戊糖到乳酸和乙酸。干酪乳杆菌属于这一组的微生物，虽然它们不常常被用在乳品发酵剂中，但在干酪的熟化中却能产生所希望的次生发酵作用。

借助磷酸转酮酶途径，专性异型乳酸发酵的乳杆菌能够发酵己糖到乳酸、乙酸(或乙醇)和CO2。戊糖也可以借助这条途径被代谢。这类乳杆菌在干酪的熟化中产气并常常产生不愉快的风味，它们产生蛋白酶、内肽酶、氨肽酶、二肽酶、三肽酶和专一性脯氨酸肽酶等。一个典型的专性异型乳酸发酵的乳杆菌是开菲尔乳杆菌，常常是与生产开菲尔发酵剂有关的种。

乳酸菌中，乳杆菌对酸的忍耐性最强，适宜于在酸性条件(pH5.5—6.2)下启动生长，且常常降低乳的pH到4.0以下。当以纯培养物接种到乳中时，乳杆菌在乳中生长缓慢。有鉴于此，为了快速启动乳的发酵过程，乳杆菌通常是与嗜热链球菌联合使用。

五、丙酸细菌

丙酸细菌是一类非芽孢的，形态多样的革兰氏阳性杆菌，能够利用蔗糖和乳酸形成丙酸、乙酸和C02，属于厌氧到微好氧的嗜温菌。丙酸细菌并不属于乳酸菌，而是与放线菌组中的棒杆菌非常相似。尽管干酪中可以分离到4种丙酸细菌，但薛氏丙酸细菌是最重要的用于干酪生产的菌种。由于原料乳中存在的丙酸细菌其数量不能满足发酵的要求，因此，它通常需要与乳酸菌一起使用以形成干酪的网眼结构。

丙酸菌能够利用有机和无机氮源，但对氨基酸的要求是不同的。大多数菌株的生长需要生物素。生产干酪的发酵剂可以在包括蛋白水解物、酵母膏和以乳酸作为碳源的复合培养基中生长。

丙酸菌可以利用干酪发酵中产生的乳酸来生长。乳酸先被氧化成丙酮酸，然后丙酮酸要么被转变成乙酸和C02，要么被转化为丙酸。C02可以使瑞士干酪和类似品种的干酪产生网眼结构，而包括氨基酸、脂肪酸的其他代谢产物对这些干酪的风味有重要影响。

六、短杆菌

短杆菌是一类需氧的、形态多样的革兰氏阳性杆菌，它可以在表面熟化干酪品种的表面生长。从这类干酪中分离出来的短杆菌通常是线状短杆菌。线状短杆菌可以产生一种橘黄色的胡萝卜素，从而使干酪表面具有特定的颜色。当与光接触时，干酪色泽的形成会加速。尽管在较老的培养物中观察到的短杆菌是球形的，但在对数生长期该菌可呈现细长的杆状。线状短杆菌不能利用乳糖或柠檬酸，但可以利用干酪发酵产生的乳酸生长。因线状短杆菌在中性pH条件下生长最好，所以只有当干酪表面的乳酸被中和或被酵母菌、微球菌代谢后，它才能良好的生长。由于表面熟化干酪属于表面盐化，所以像酵母菌和微球菌一样，线状短杆菌能在高盐浓度下生长良好。

线状短杆菌具有很高的蛋白水解活性，能够降解乳清蛋白和酪蛋白。因能够使氨基酸降解成铵以及使蛋氨酸降解为巯基甲烷，所以线状短杆菌在表面熟化干酪浓郁风味的形成中具有一定的作用。线状短杆菌产生的其他挥发性物质也会影响表面熟化千酪的典型风味，这些物质是丁酸、己酸、苯甲醇等。线状短杆菌在含有蛋白水解物、葡萄糖、酵母膏、磷酸钾、硫酸镁的培养基中生长良好。

七、肠球菌属

肠球菌属是将原先Lancerield D组的链球菌，即粪链球菌和屎链球菌重新定名为粪肠球菌和屎肠球菌。自1984年建立肠球菌属以来，有9个种是来自于原先的链球菌属，并新增加了10个新种。肠球菌是一类革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的微生物，能利用葡萄糖进行同型发酵，产生L型乳酸，也能从氨基酸降解中获得能量。它们拥有磷酸烯醇丙酮酸磷酸转移酶系统，从而能够吸收利用乳糖和其他的碳水化合物，包括葡糖酸。

肠球菌常被用作食品安全的指示菌，它可能与通过食物传染的疾病有关。在南欧生产的干酪中，人们用肠球菌作为发酵剂。此外，商业上人们也利用它们作为益生茵，以便预防和治疗肠道菌群失调疾病。所有肠球菌中，仅有粪肠球菌和屎肠球菌可以作为重要的益生菌。这两种肠球菌可以借助它们对阿拉伯糖和山梨糖醇的发酵状况，借助它们在生长温度等方面的差异区分开来。

八、双歧杆菌属

双歧杆菌属于放线菌科，其代谢产物是乳酸和乙酸，两者的比例为2：3。双歧杆菌拥有6一磷酸果糖磷酸解酮酶，但乳酸菌不具有这种酶。正是因为双歧杆菌DNA的G+C含量很高[约为55%～57%(摩尔分数)]以及它们在生物系统发育中的位置，人们才将其划归到革兰氏阳性菌的放线菌中。然而，29个双歧杆菌菌种在形态上表现出极大的差异，所以双歧杆菌的分类和命名仍处在不断的发展中，以至于现在正在使用的许多双歧杆菌益生菌仍缺乏适宜的种名。鉴于生化反应并不能总是非常有效地对从乳品中分离出来的菌株进行分类，所以只有采取多种手段并用，即采取基因型和表型特征的结合的办法才能够对不同的双歧杆菌菌种进行分类。双歧杆菌的自然生长环境是寄主的肠道，但在污水、阴道微生物菌群、牙齿缝等环境中也能找到它们。作为益生菌应用的最重要的双歧杆菌是长双歧杆菌、两歧双歧杆菌和动物双歧。

双歧杆菌菌株具有不同的酶促能力，所以很难采用一种培养基来对所有的菌种进行培养。从技术角度上，选择双歧杆菌菌株作为益生菌的标准包括：①在廉价培养基中生长，获得高细胞浓度的能力；②菌体在浓缩中维持健壮的能力；③菌体收获、添加保护剂冷冻或冷冻干燥的抗性能力等。此外，菌体必须能够在产品的整个货架期内维持其活性和特性。从医学角度上，选择双歧杆菌作为益生菌的标准包括：①对胃、小肠、胆盐的耐受力；②生理性的生长与持续性能力；③在上皮细胞上的黏附能力；④在上皮细胞上的生长能力和持续性；⑤凝集作用的能力；⑥抗菌物质的产生和敏感性等。

可能是缺乏小肽和自由氨基酸的缘故，双歧杆菌在乳中的生长能力非常弱。当在乳中添加酪蛋白水解物或酵母膏时，某些菌株表现出较好的生长能力。那些能在乳中生长良好的双歧杆菌菌株或许是受到了某些自然存在的生长因素刺激，比如受到特殊的酪蛋白衍生物或者寡聚糖的刺激。

由于双歧杆菌具有平衡人体肠道系统的作用，所以，最近人们更加有意识地将双歧杆菌投放到乳品中。在酸奶中，因为双歧杆菌产酸较慢，所以双歧杆菌通常和普通的酸奶菌种一起使用来制作酸奶。然而，后酸化以及德氏乳杆菌保加利亚亚种生成的拮抗物质或许对双歧杆菌在乳品中的存活产生不利影响。尽管多数双歧杆菌是酸敏感型的，但某些菌株仍能在pH低至4.0的条件下存活。双歧杆菌在乳中的存活能力受到贮藏温度、初始茵数、贮藏时间和测试菌株的影响。在于酪中，尽管存在不利的盐浓度和贮藏温度等因素，双歧杆菌仍能维持较高的数量。通常，双歧杆菌对逆境条件会表现出多样化的反应，因此，选择合适的菌株是非常重要的。

九、青霉菌

青霉菌属于半知菌门丝孢菌纲的微生物。属于这个纲的霉菌直接在菌丝或分生孢子梗上产生分生孢子。青霉菌的分生孢子梗从菌丝和接近尖端的分枝上垂直升起，形成一个像扫帚状的末端。两组青霉菌经常应用于干酪生产，它们是白青霉和蓝青霉。常用的白青霉菌是坎培波尔特青霉，这种青霉菌可以在坎培波尔特软干酪、布里干酪或类似干酪品种的表面生长。常用的蓝青霉菌是洛克菲特青霉，这种青霉菌主要用于生产像法式洛克菲特干酪、意大利哥根索拉干酪和斯提尔敦干酪等蓝纹干酪品种。蓝青霉菌可以在蓝纹干酪的内部生长。坎培波尔特青霉与共同青霉菌(P．comm“以e)亲缘关系较近，而共同青霉菌是干酪生产中最常见的污染菌种，它能产生多种毒素；而坎培波尔特青霉仅产生一种真菌毒素，即环状降片酸。洛克菲特青霉与肉色青霉菌和潘氏青霉亲缘关系较近。肉色青霉菌可以产生展青霉毒素；而潘氏青霉既可以产生展青霉毒素，也可以产生真菌毒素球二孢素。

坎培波尔特青霉和洛克菲特青霉均具有分解脂肪和蛋白质的能力，两者都能产生甲基酮和自由脂肪酸，但洛克菲特青霉能产生较高水平的甲基酮和自由脂肪酸，所以可以赋予蓝纹干酪独特的风味和香味。坎培波尔特青霉可以产生一种极为复杂的混合物，从而影响坎培波尔特干酪和布里干酪的风味，这种复杂的混合物主要是由2一庚烷、2一庚酸、1一辛烯一3一辛醇、2一壬烷、酚、丁酸和甲基肉桂酸等构成。

十、酵母菌

除乳酸菌外，乳中的酵母菌可进行所谓的乳酸和乙醇的发酵。在乳品生产中，这种类型的发酵仅限于开菲尔乳和马奶酒的生产。在开菲尔发酵剂中，即在人们通称的开菲粒中，尽管其确切的微生物组成依旧处在争论中，但Tamin和Robinson指出，开菲尔假丝酵母和高加索乳杆菌是开菲粒中经常能分离到的主要微生物种类。Meyer等1984年指出，开菲尔粒中占优势的酵母菌种类是开菲尔假丝酵母菌或马克西努克鲁维氏酵母菌。显然，对开菲尔乳而言，开菲尔假丝酵母是重要的。从生理形态上，当在25℃培养3d时，开菲尔假丝酵母能在含葡萄糖、酵母膏和蛋白胨的液体培养基中形成短到长的卵形细胞。生长在琼脂培养基上，开菲尔假丝酵母能维持一个月的活性，菌落呈奶油般黄色状，柔软，具精美的网状外观。当生长在玉米浆培养基中，假菌丝看上去像粗糙、略为弯曲的枝条。它的DNA G+C含量是41.3%，能够发酵葡萄糖、半乳糖和蔗糖产生乙醇；而乳糖的发酵能力是可变的，与采用的菌株有关。

菌种的选择菌种的选择对发酵剂的质量起着重要作用，应根据生产目的不同选择适当的菌种。同时对菌种发育的最适温度、耐热性、产酸力以及是否产生黏性物质等尤其要特别注意。一般选用两种或两种以上的发酵剂菌种混合使用，相互产生共生作用。目前通常选用的基本菌种是嗜热链球菌和保加利亚杆菌，以及乳酸链球菌等。但根据目的不同可以追加不同的其他乳酸菌，如：①为了提高酸奶的保健作用，追加嗜酸乳杆菌和双歧杆菌等功能菌，增加这些菌在肠道的定殖能力；②为了增加产品的营养和生理价值，可以添加能合成维生素的特殊菌，特别是合成B族的乳酸菌，如能合成维生素B12的谢氏丙酸杆菌，能合成维生素B12和维生素B2的明串珠菌，能合成烟酸、维生素C、维生素B12的嗜酸乳杆菌等；③为了改善产品的风味，可添加双乙酰乳链球菌或明串珠菌，属于产香菌；④为了改善产品的硬度，可添加能产生黏性物质的乳链球菌变种；⑤为增强对生长阻碍物质(特别是青霉素)的抗性，可添加乳酸片球菌。

菌种配合时一般是嗜热链球菌和保加利亚杆菌按1：1比例配合，乳酸链球菌与保加利亚杆菌以4：1配合，常用作发酵乳的发酵剂菌种。选择质量优良的发酵剂应从以下几方面考虑。

产酸能力不同的发酵剂产酸能力会有很大的不同。判断发酵剂产酸能力的方法有两种，即测定酸度和产酸曲线。产酸能力过强的发酵剂在发酵过程中容易导致产酸过度和后酸化过强，而产酸能力弱的发酵剂在生产中产酸过慢，发酵时间过长，容易导致杂菌污染，所以生产中一般选择具有适度产酸能力的发酵剂。

后酸化后酸化是指酸乳生产中终止发酵后，发酵剂菌种在冷却和冷藏阶段仍能继续缓慢产酸，它包括三个阶段：从发酵终点(42℃)冷却到19℃或20℃时酸度的增加；从19℃或20℃冷却至10℃或12℃时酸度的增加；在冷库中冷藏阶段酸度的增加。酸乳生产中应选择后酸化尽可能弱的发酵剂，以便控制产品质量。

产香性一般酸乳发酵剂产生的芳香物质为乙醛、丁二酮、丙酮和挥发性酸。评价方法有：

1)感官评价

进行感官评价时应考虑样品的温度、酸度和存放时间对品评的影响。品尝时样品温度应为常温，因为低温对味觉有阻碍作用；酸度不能过高，酸度过高会将香味完全掩盖；样品要新鲜，用生产24～48h内的酸乳进行品评为佳，因为这段时间内是滋味、气味和芳香味的形成阶段。

2)挥发性酸的量

通过测定挥发性酸的量来判断芳香物质的产生量。挥发性酸含量越高就意味着产生的芳香物质含量越高。

3)乙醛生成能力

乙醛是形成酸乳的典型风味的主要因素之一，不同的菌株产生乙醛的能力不同，因此，乙醛生成能力是选择优良菌株的重要指标之一。

黏性物质的产生发酵剂在发酵过程中产黏有助于改善酸乳的组织状态和黏稠度，特别是酸乳干物质含量不太高时显得尤为重要。但一般情况下产黏发酵剂往往对酸乳的发酵风味会有不良影响，因此选择这类菌株时最好和其他菌株混合使用。

蛋白质的水解性乳酸菌的蛋白水解活性一般较弱，如嗜热链球菌在乳中只表现很弱的蛋白水解活性，保加利亚杆菌则可表现较高的蛋白水解活性，能将蛋白质水解，产生大量的游离氨基酸和肽类。影响蛋白质水解活性的因素主要有：

1)温度

蛋白质水解活性低温(如℃冷藏)下低，常温下增强。

2)pH

不同的蛋白水解酶具有不同的最适pH，pH过高易积累蛋白质水解的中间产物，给产品带来苦味1。

发酵剂菌种的分离、鉴别与活化制造酸奶时，如果没有纯培养的发酵剂原菌，可以向菌种保藏单位购买。这种菌一般都是纯培养的粉末状干燥菌，密封在小玻璃瓶里，使用时可根据说明书进行扩大培养以制备发酵剂。若索取不到纯培养原菌，可以从天然牛奶或酸奶里分离，经过鉴定、筛选之后，再制成发酵剂原菌。可按照下述操作程序进行。

分离取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释，取其中的10-4、10-5两个稀释度的稀释液各0.1～0.2mL，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接用接种环蘸取原液平板画线分离，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

鉴别选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8～24h。若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4-6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。可参照细菌鉴定手册进行鉴别。

活化保存日期过长，活力已很弱的发酵剂原菌，使用时必须进行活化，可在培养基中添加1%—3%的酵母自溶膏和0.15%的柠檬酸钠、葡萄糖与酵母浸膏，或向每100 mL培养基中添加2.5mg脯氨酸或0.09%的谷胱甘肽增强菌的活性。VC、叶酸、VA、VB1、尼克酸、番茄汁或肝浸出液等也有刺激和增强菌的活性的作用。活化可用脱脂乳培养基添加上述微量成分后在试管内接种原菌，于40～42℃培养4～8h，取出再接种于新的试管中培养，如此继续进行3-4代之后，即可充分发挥其活性，最后放4℃冰箱贮存备用2。