[科普中国]-定位突变

简介

基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。基因定位突变是指从基因水平上进行蛋白质分子的改造，即采用定位诱变的方法，对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入、删除、置换和改组，然后对突变后的基因进行蛋白表达并分析所表达蛋白质的功能活性，其结果为蛋白质分子改造提供新的设计方案。

定位突变的设计目标及解决方法定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构一功能关系的研究等。Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法，至今仍有重要的参考价值。其中蛋白质的稳定性是蛋白质正常发挥生物活性的重要前提，因此改善蛋白质的稳定性成为蛋白质设计和改造的重要目标之一。

定位突变的种类要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，还可以分为以下三类：插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。

定点突变蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码子决定的，只要改变其中的一个或两个碱基就可以改变氨基酸的种类，从而产生新的蛋白质。通常是改变功能区域某个位置的氨基酸，以研究蛋白质的结构、稳定性或催化特性。点突变的工作是当前蛋白质工程研究的主体，到目前为止，已经对枯草杆菌蛋白酶、T4溶菌酶、二氢叶酸还原酶、胰蛋白酶以及核糖核酸酶等许多种类的蛋白质进行改造试验。例如，将组织型纤维蛋白酶原活化剂(tissue-type plasminogen activator，t-PA)的Asn117替换为Glu117，从而除去一个原有的糖基化位点；由于该处原有的糖链能促进t-PA从血浆清除，因此点突变后能够降低t-PA的血浆清除率，延长血浆半衰期。

盒式突变1985年Wells提出的一种基因修饰技术一盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧添加两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。

定位突变的程序基因定位突变的蛋白质分子设计程序遵循设计原理中的程序，但基因定位突变又有其特殊性，其具体的程序如下。

1、建立所研究蛋白质的结构模型

建立蛋白质三维结构模型，对确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能是至关重要的。可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。

2、找出对所要求的性质有重要影响的位置

在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。例如，通过引入二硫键期望提高蛋白质的稳定性，面临的一个问题是怎样选择合适的突变位点。蛋白质中的二硫键具有一定的结构特征，随机选择突变位点引入二硫键会给整个分子带来不利的张力，不但不会提高蛋白质的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。选择突变残基，最重要的信息来自结构特征。因此，如果蛋白质的立体结构是未知的，则突变功能残基的研究带有不确定性，不能很好区别蛋白质构象扭曲变化的影响与原有功能残基突变的影响。①为解决这个问题，人们尝试了几何方法、分子力学方法、分子动力学等多种方法，并已经编制了一些实用的程序，可以在试验前筛选可能的以及较好的突变位点。相类似的，对于其他类型的突变也可以进行预测。目前已有许多方法和程序可以在已知天然蛋白质结构的基础上预测突变体的结构和性质，这些设计工作为人们的实验工作提供了信息和指导；②可以根据序列同源性或原先的生物化学实验证据来选择突变残基，也可以通过随机或合理筛选技术鉴定重要的功能区域，以便进一步重点分析蛋白质功能残基；③可以从天然蛋白质的三维结构出发，利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸。同一家族中的蛋白质的序列对比、分析往往是一种有效的途径。需要认真考虑此种性质受哪些因素的影响，然后逐一对各因素进行分析找出重要位点，这是分子设计的关键。

在具体选择突变残基时，一方面要满足蛋白质可能具有所要求的性质，另一方面又尽量维持原有结构，使其不做大的变动。尽量在同源结构中此位点已有的氨基酸残基表中进行选择，同时考虑残基的体积、疏水性等性质的变化所带来的影响。还应确定序列中对折叠敏感的区域，确定对功能重要的位置，考虑剩余位置对所希望改变的影响，考虑它们对结构特征的影响，以及它们对蛋白质功能的影响。

3、预测突变体的结构

根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质结构一功能或结构一稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质，同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。

4、构建突变体。获得突变体蛋白

依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。

5、突变体蛋白质的检验

测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，同时进一步修正设计方案。要得到具有预期结构与功能的蛋白质是不容易的，可能需要经过几轮的循环才行1。

定位突变残基的鉴定对于新蛋白质的功能分析，最重要的是对数据的解释。在数据分析过程中，如何区别由功能残基替换引起的效应及蛋白质构象变化引起的效应是所有突变分析中共同存在的困难。对于三维结构未知的蛋白质这个问题尤为严重，因为我们无法确定残基的立体位置与周围结构环境，残基对溶剂的暴露程度以及同附近残基的相互作用。下面介绍几种新蛋白质突变残基的鉴定方法。

1、根据结构信息确定残基的突变

这种方法是鉴定新蛋白质分子中突变残基最有效最直接的方法。可利用X射线或NMR进行新蛋白质分子的三维结构测定，这种方法可以直接提供突变蛋白的高分辨率结构及评估结构整体性。根据新测定的三维结构与突变前的三维结构进行分析比较。重点分析突变位点的氨基酸残基在三维结构中的位置，以及与其他基团之间形成的氢键、离子对或疏水相互作用等，以证实该位点残基在蛋白质分子的结构与功能中的作用。Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰一tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3'羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。蛋白质三维结构的测定，可用于鉴定最暴露于蛋白质表面的残基，还可用于估计专一性突变对结构改变的可能性。这种方法需要较大量的纯的突变蛋白，并要花较长时间，因此这种技术不能用于常规的大量突变体的分析。

2、突变方法鉴定突变功能残基

定点突变引起的结构变化可以通过在蛋白质中引进另外一种突变来检测。这种多重突变中单一突变是有加和性的，偏离这个规则说明残基问的相互作用引起构象的变化。随机突变、删除分析以及连接片段扫描突变等实验方法可用于鉴定功能残基。随机突变技术分析蛋白质功能的优势在于通过简单的方法就可产生突变体，但必须进行大数目的突变产生大量可解释的数据，因为随机突变对于突变没有加以控制。删除分析及连接片段扫描突变涉及在整个基因位置删除或插入少量的核苷酸，此类突变可以很容易通过重组DNA技术构建。这两种技术已经非常成功地用于确定在基因调控区域的DNA序列单元，这些方法也可用于蛋白质的分析。

3、利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基

将感兴趣的目的蛋白质序列与同源蛋白质进行序列比较，可以发现一些高度保守的残基，这些残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关，因此通常将它们作为突变及功能进化的候选残基。每个残基所起作用的信息能够通过与不同种同源蛋白的序列比较或一类具有相应活性的蛋白质的序列比较而获得。另外同源蛋白质保守的残基是保持那类蛋白质共同功能或者是维持共同结构的关键因素，因此在一类蛋白质内非保守残基的变化可能涉及每个蛋白质独特的功能，如底物或结合专一性。因此非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。

此外，还可以利用蛋白质的溶解性、热力学分析及NMR谱等方法探测突变蛋白质结构的整体性质，以鉴定突变残基。在某些情况下，突变可能破坏蛋白质的球形整体结构，引起蛋白质失活、不溶性以及在细胞中降解，因此溶解度与突变蛋白质的稳定表达可以作为结构整体性的一个标志。热力学分析可以用于测量突变蛋白质的热稳定性及化学变化自由能，并可作为构象整体性的检测。除此以外，圆二色谱法可以快速分析突变体结构，但该方法存在很明显的不足，即需要较大量的纯突变蛋白，而且只提供二级结构及三级结构的相对变化。如果突变后的蛋白质仍保持蛋白质的整体构象，我们可以利用单克隆抗体的结合能力探测突变蛋白的构象变化，因为只有在单克隆抗体的抗原决定簇与突变位点重叠时，这种结合才会受到影响。然而，这种方法也只能检测蛋白质表面的构象变化，对于埋藏在口袋中的残基(如酶的活性位点)的结构微小变化是无法检测的。

利用突变的方法研究蛋白质的功能很难区别突变效应和结构微小变化之间的关系，因此带有一定的不确定性。比较好的解决办法是尽可能多地了解蛋白质的结构、进化保守以及生物化学信息，以减少突变过程对结构产生的影响。最好的突变策略依赖于所涉及的蛋白质、生物体系以及已掌握的信息2。