[科普中国]-α-乳白蛋白

定义

α—乳白蛋白是牛乳清中第二大丰富的蛋白质，在乳中浓度大约为1 mg·mI-1。大约30年后，发现α—乳白蛋白不仅仅具有营养功能，而且也是乳糖合成酶(EC2.4.1.22)的重要成分，它催化乳中主要碳水化合物—乳糖的合成。牛乳α—乳白蛋白的多级结构也说明了它与来源于禽类和哺乳动物的溶菌酶的氨基酸序列和二硫键对很相近，说明α—乳白蛋白基因是由溶菌酶基因复制引起的，随后通过突变产生进化趋异。因此，通过前哺乳动物基因和蛋白质产物的修饰形成了哺乳动物产生这种特异蛋白质和乳糖的特殊能力。现在已经确定了α—乳白蛋白对与乳糖合成有关的乳糖产生和乳分泌的基本作用，并测定和了解了三维结构和活性分子基础。然而，来源于基因组计划中的新信息表明a一乳白蛋白起源和乳糖合成可能比最初考虑的更加复杂。

α—乳白蛋白在蛋白质研究方面继续起着重要作用。近几年，它已经成为研究蛋白质自然折叠成天然结构机制的通用模型，人们对此过程理解甚少，并且该过程是基因信息表达的关键步骤。此处用“α一乳白蛋白”表示被广泛研究源于牛乳的α—乳白蛋白，而来源其他哺乳动物的相关蛋白质(直系同源)将用种名来鉴定。1

一般性质和物种差异α—乳白蛋白的单个多肽链包含123个氨基酸残基，并含有通过4个二硫键共价连接的8个半胱氨酸，全部分子质量为14 186Da，等离子点(pI)为4.8。α—乳白蛋白发现于3个主要哺乳动物的分支中：真哺乳亚纲动物、有袋类动物、产卵单孔类动物。与牛乳清中分布最丰富的蛋白质α—乳球蛋白相比，α—乳球蛋白发现于有限哺乳动物乳中。来源不同哺乳动物的a一乳白蛋白带有121～123个氨基酸残基的多肽链并在大小上相似，除含有17个氨基酸C端延伸和140个残基链长的鼠乳α—乳白蛋白外；所有阴离子蛋白质pI为4.4～5.1。不同哺乳动物盯乳白蛋白之间氨基酸序列差异随物种亲缘性降低而增加。例如，牛乳α—乳白蛋白与羊乳蛋白质有94%一致性，与人乳有76%一致性，但是仅仅与塔马尔沙袋鼠蛋白质有50%一致性，与单孔类动物鸭嘴兽乳蛋白有47%一致性。

大约10%的牛乳α—乳白蛋白分子是糖蛋白，载运单个、典型的N连接聚糖给Asp44。一些哺乳动物的α—乳白蛋白，如鼠有极高比例的糖基化分子，而包括母乳在内的α—乳白蛋白未被糖基化；目前证据表明，碳水化合物在结构和活性中不起作用。1

结构一级结构α—乳白蛋白和C型(Chicken型)溶菌酶在氨基酸序列中有极高相似性，确定了它们的氨基酸序列高度相似，并由mRNA序列、基因结构、三维结构相似性得以增强。溶菌酶是抗菌酶，能够催化微生物细胞壁肽聚糖链之间单糖断裂，作为糖苷转移酶底物特异性的调节剂明屁不同于α—乳白蛋白作用。高度功能性差异与氨基酸序列高度同一性形成强烈对照，对一些α—乳白蛋白/溶菌酶而言，同一性超过40%。

从昆虫到哺乳动物等许多物种中发现了C型溶菌酶，然而乳糖和a一乳白蛋白仅存在于哺乳动物乳中。根据这点，最初认为d乳白蛋白基因来源于与同哺乳动物来源相近的溶菌酶基因的复制。在这个模式中，一个基因拷贝的突变引发功能变化，并产生α—乳白蛋白和乳糖合成酶。α—乳白蛋白的来源是哺乳动物合成乳糖独特能力的关键，因为在非哺乳动物巾发现了β一半乳糖转移酶一1，此来源的酶能在哺乳动物的α—乳白蛋白存在下被诱导催化乳糖有效合成。然而，用现代分子系统发育学方法分析α—乳白蛋白和溶菌酶的序列说明α—乳白蛋白起源是古老的，先于存在于哺乳动物之前的鱼类和四足动物的分支。由于多元溶菌酶基因片段存在，使这个序列图变得很复杂，从人类基因组序列和cDNA序列文库中，可以判断与新型功能性质相关其他溶菌酶存在。因此，表明α—乳白蛋白和溶菌酶的关系是复杂的，并且在此过程巾带有不同功能性质的蛋白质可能“环节缺失”(miss link)。2

三维结构α—乳白蛋白的第一晶体结构测定的事狒狒蛋白质，现已掌握了牛、羊、豚鼠和水牛的蛋白质结构，并在细菌细胞中产生了牛蛋白质重组形式。所有的α—乳白蛋白都带有一个包含α—单环、和310螺旋较大亚结构域的双片结构；其形成自多肽链N端和C端区域。较小的亚结构域包含一个小三股反向平行的β折叠，多肽链中心区域形成的结构不规则。两个叶被一个接近末端的裂口分开，而钙结合“弯管”定位在它的连接处。

对结构很重要的钙离子通过Asp82、Asp87、Asp88侧链上羧基和Lys79、Asp84肽羰基进行配位。Ca2+的二锥体配位由两个水分子完成。测定了人α—乳白蛋白的无Ca2+形式载体蛋白结构，其结构通过高离子强度在同有状态下保持稳定。这在空的金属结合位点显示出微小结构变化，但是蛋白质的相反面巨大变化导致在两个叶间和蛋白质基团与水分子额外反应之间相互作用减少。这说明了在中间产物折叠过程钙对叶间相互作用的促进作用。

其他的结构研究已经显示，通过两个不同旺乳白蛋白分子相互作用，Zn2+在裂口处结合，连接着与二聚体结合的锌。在高浓度钙离子条件下，第二个钙离子结合在最初钙位点附近区域。

α—乳白蛋白的105~110残基在高pH条件下，产生的蛋白质结晶以螺旋构象存在。在低pH，晶体以环构象存在。这反映了溶液中此区域构象变化的能力，这是对His108离解作用的响应。结构中这个区域和邻近区域的柔性对α—乳白蛋白活性很重要，使其进行结合β—半乳糖转移酶一1的结构调整。2

基因结构人的α—乳白蛋白和溶菌酶的基因定位在染色体12上。两个基因都含有被3个非编码区域(内含子)所分开的4个编码区域(外显子)；它们与各自蛋白质的氨基酸序列有关，内含子定位在活性a乳白蛋白分子的序列是在Trp26、Lys79、Trp105密码子中等效位置。已测定出来源于其他哺乳动物的α—乳白蛋白基因的结构，包括牛和山羊。比较不同物种和其他乳蛋白质的a哥L白蛋白基因5‘端非编码区域已经发现一个在泌乳过程中对它们可调表达似乎很重要的保守序列(milk box)。2

功能结合金属离子所有已知的d乳白蛋白含有一个紧密结合的Ca2+，强烈地影响着稳定性和结构，但是在乳糖生物合成中α—乳白蛋白活性不需要Ca2+。除去Ca2+需要通过螯合剂长时间处理或低pH条件破坏结构，导致蛋白质稳定性较大程度地降低。在室温和低离子强度下，载体蛋白(无钙)经历了从三维结构到“熔球”状态的变化。作为一个熔球，蛋白质保持大多数原来的二级结构，但没有固定的三级结构；因此，溶球状态在远紫外光区域(190～240nm)有典型的圆二光谱，这个区域强烈地被二级结构含量所影响，这与其他天然蛋白质很相似。然而，近紫外光圆二光谱(250～320nm)在消失或强度方面极大程度降低，该光谱区与天然蛋白质中芳香氨基酸侧链固定结构环境相关联。熔球状态与原有状态相比也有略微延伸的分子半径，能结合疏水分子，包括一些染料和磷脂。其他蛋白质在不稳定的条件下形成熔球，但是a哥L白蛋白这种结构形式被广泛地研究，因为在盐酸胍或尿素诱导变性之后的再卷曲过程中它与早期过度中间产物显现同一性。因为a一乳白蛋白熔球状态在限定条件下是稳定并平衡的，可以根据光谱方法详细的鉴定，包括核磁共振技术。

除Ca2+之外，其他的金属离子，如Zn2+、Mn2+、H92+、Pb2+，和镧系元素也结合α—乳白蛋白，钙和锌键的位点和第二个较弱的结合Ca2+位点可通过X衍射结晶学描述这两个位点的结构。第一个钙结合位点在氨基酸序列中涉及一个高度特异的天冬氨酸残基簇。尽管仅测定了很少的几种哺乳动物的α—乳白蛋白结构，但是所有知道的α—乳白蛋白高度特异序列基序的存在说明了其都有高度亲和钙结合活性。尽管Ca2+对α—乳白蛋白活性没有直接作用，但是发现其对蛋白质变性，还原断开二硫键，折叠其形成天然结构和在8个半胱氨酸之问形成正确的二硫键交联是必要的。对有效折叠来说，Ca2+的需要表现为与将钙结合到折叠途径中的限速中间产物有关，还可能存在一些调控作用。没有证据证明其他金属离子与α—乳白蛋白的结合有任何生物学作用。2

在乳糖合成中功能在泌乳中乳糖的合成涉及乳糖合成酶系的活性，此酶系可催化半乳糖从它的活性衍生的尿核二磷酸(UDP)一半乳糖转移到葡萄糖吡哺糖环4号位。

乳糖合成酶的催化组分是UDP一半乳糖β一N一乙酰氨基葡萄糖苷β一1，4半乳糖转移酶一1(β一半乳糖转移酶一1；EC2.4.1.38)，是哺乳动物中7个相关半乳糖基转移酶的成员之一，在半乳糖和不同的受体之间催化形成β—1，4键。β一半乳糖苷转移酶一1发现于哺乳动物中的许多不同组织中，并且它在糖蛋白糖链中催化半乳糖β一1，4一N一乙酰氨基葡萄糖苷键形成。

与大多数糖基转移酶催化真核生物中配糖体过程的步骤一样，β一半乳糖苷基转移酶一1是2型膜蛋白，这种命名说明它有一个小的N端区域定位在细胞质中，一个与非极性侧链相连含有20个氨基酸的膜锚定区域、一个主干区和C端催化域。β一半乳糖苷基转移酶一1能单独催化乳糖合成，但是效力极差，因其结合葡萄糖能力弱，这反映在其Km(Michaelis常数)为l～2mol·L-1，常数值太高而不能被准确测定。随后，葡萄糖浓度(毫摩尔)在生理学范围内，β一半乳糖苷基转移酶一1以极弱的速率催化乳糖的产生。α—乳白蛋白与β一半乳糖苷基转移酶一1催化域之间的相互作用提高了葡萄糖的结合力，因此，Km减少1000倍左右，在泌乳时乳糖合成酶系(β一半乳糖苷基转移酶一1和α—乳白蛋白)能催化乳中合成所需大量的乳糖。

β一半乳糖苷基转移酶一1拓扑学和定位说明乳糖合成发生在泌乳乳腺上皮细胞反高尔基膜囊膜内腔中(与细胞质分离的内部区域)。α—乳白蛋白是分泌性蛋白，最初在泌乳的乳腺细胞中合成，是一个带N端分泌信号序列(该序列蛋白异位到内质网内腔后蛋白水解消失)的前体蛋白质。像其他分泌的蛋白质一样，α—乳白蛋白从内质网转递到高尔基体的内腔中，在此处遇到与膜连在一起的β一半乳糖苷基转移酶一1的催化域。α—乳白蛋白和盱半乳糖苷基转移酶1相互反应是高度可逆的，仅在配位体存在条件下发生，UDP一半乳糖和单糖显著提高。乳腺细胞中的乳糖被包裹进分泌泡中随α—乳白蛋白一起分泌到乳中，分泌泡形成白高尔基体膜，并通过胞吐作用在细胞表面释放内容物。这种排列有重要的含义。乳糖是许多乳中主要的渗透压分子，高尔基膜中存在的乳糖产生水的渗流进入到细胞这层中，产生乳大部分水相。其次，β一半乳糖苷基转移酶一1/α—乳白蛋白相互反应的短暂性质和α—乳白蛋白分泌确保了乳蛋白的连续表达和乳糖合成之间的联系，说明α—乳白蛋白合成对乳的有效分泌很重要。最近的研究证明母鼠α—乳白蛋白乳白蛋白基因被敲除，乳汁分泌被严重地干扰。不能合成含α—乳白蛋白的动物仅能产生少量缺α—乳糖的黏稠乳；因为没有充足的营养，它们的胎仔死亡。2

其他的功能性质一些研究描述了未被其结合的β一半乳糖转移酶一1所介导的α—乳白蛋白的活性。首先在泌乳动物乳腺中和池塘蜗牛中，检测发现酶催化GlcNAc从UDP-GIcNAc转移到GlcNAc活性被α—乳白蛋白所影响，以及葡萄糖作为受体底物产生一个新的二糖——GlcNAc β—1，4葡萄糖。这说明α—乳白蛋白或相关蛋白对葡萄糖转移酶专一性调节可能有更广泛的作用。

其次发现人结合脂肪酸的αpo—α—乳白蛋白对一些肿瘤细胞具有选择性的细胞凋亡作用。此结论提出乳对哺乳后代的可能保护作用。这些活性生物作用仍不清楚，因为小鼠α—乳白蛋白基因的断裂说明了它唯一的生物学作用可能是在乳糖合成中。然而，在其他哺乳动物中存在其他功能作用的可能性不能被排除。2