[科普中国]-游离脂肪酸含量

滴定法方法原理

将样品溶解在混合试剂中，用标准的氢氧化钾溶液滴定存在的游离脂肪酸1。

试剂乙醚；

95%乙醇；

0.1mol/L氢氧化钾标准溶液：按GB/T601制备标定。

中性混合试剂：乙醚+95%乙醇，1+1（V+V）

指示剂：1%酚酞乙醇溶液

方法参照表1称取试样注入锥形瓶中，加入中和的混合溶剂100mL，加入酚酞指示剂0.5mL，用0.1mol/L氢氧化钾溶液滴定至粉红色（持续30sec）。

结果计算式中：V——所用标准氢氧化钾溶液的体积，mL；

C——所用标准氢氧化钾溶液的浓度，mol/L

56.1——氢氧化钾摩尔质量，g/mol

m——试样的质量，g

近红外光谱法仪器与试剂Antaris II FT-NIR 型光谱仪，配TQ Analyst 8,、Result Integrantion 和Result Operation软件

酚酞-乙醇溶液：10g/L

中性混合试剂：乙醚95%（体积分数）乙醇体积1:1组成的混合溶液。

仪器工作条件样品台温控模块温度设定为60℃， 60选择透射扫描模式，扫描波数4000-12000cm-1，扫描次数为32次,分辨率为8cm-1。

试验方法采集光谱前仪器预热1h。采用滴管移取少量样品于样品管中， 将样品管插入样品台中的杯架中。先进行参比（空气）扫描，参比扫描结束后，再扫描样品。采用TQ Analyst8软件进行数椐处理，以偏最小二乘（PLS）回归算法建立模型，将样品分为校正集和验证集。采用校正集样品建立校正模型并采用验证集样品进行验证，最后根据校准决定系数、内部交叉验证决定系数、预测决定系数、验证均方差（RMSEC）、交叉验证标准差（RMSECV）及预测标准差（RMSEP）等指标确定最优校正模型2。

气相色谱法游离脂肪酸的提取取样品，于100mL 离心管中，加入二氯甲烷－甲醇溶液( V/V = 2∶1)，0.0001g，然后匀浆、4000r /min 条件下离心5min; 取出离心管后，分别取下层溶液和上层溶液于具塞试管中，加入20%的0.88% KCl 溶液后混匀，过夜分层后取下层液体真空干燥，所得物质即为粗脂肪。当得到总脂肪后，加入酮－甲醇溶液( v /v = 2∶1) 和Amberlyst－A26 阴离子交换树脂于恒温振荡器中震荡2h 后去除溶液，用丙酮－甲醇溶液洗5 次( 共用20mL) ，最后在通风橱中用氮气将交换树脂吹干后待甲酯化3。

甲酯化在圆底回流瓶中加入提取的油脂或吸附后的树脂并加5mL 0.5mol /L 的氢氧化钠甲醇溶液混匀后连接回流装置。在100℃水浴中加热回流5min，然后加3mL 三氟化硼－ 10% 甲醇溶液反应5min，最后加入2mL 正己烷回流萃取2min，取出冷凝装置将回流瓶冷却至室温后加NaCl 饱和溶液混合，并将其移入具塞试管中，反复冲洗回流瓶3 次将洗液一并倒入具塞试管中静置。待分层后吸取上层溶液( 正己烷层) 约lmL 于样品瓶中，于4℃下保存，以备气相色谱仪分析。

GC 条件气相毛细管柱为Agilent SP－2560，100m × 0.25mm i.d × 0.2μm，柱初始温度60℃，以8℃ /min 升温至180℃，1.5℃ /min 升温至240℃，保持3min; 气化室温度250℃; 载气: N2; 柱流速:1mL /min; 分流比: 30∶1; 进样量1μL。

数据分析结果采用与标准品对照法定性及内标定量，并以平均值± 标准偏差( mean ± SD) ( n = 5) 的形式表示。数据采用SPSS 16.0 统计分析软件进行数据分析，利用方差分析( One－Way ANOVA) 检验数值间的差异显著性，当p 柱前衍生HPLC 法

油脂水解产物中游离脂肪酸的检测主要利用气相色谱法, 但预处理步骤较为繁琐, 需要通过改变水解产物pH 值或利用薄层色谱预先将游离脂肪酸分离。柱前衍生HPLC 法测定游离脂肪酸不需要分离游离脂肪酸的前处理, 且HPLC 检测分离温度较低, 脂肪酸热降解程度大大降低, 具有气相色谱法无可比拟的优越性而得到了广泛的应用。目前, 利用柱前衍生HPLC 法测脂肪水解产物中游离脂肪酸的研究国外已有论文发表4。

实验仪器Agilent -1100 型高效液相色谱、Zorbax SB -C18柱:美国安捷伦科技有限公司。

色谱条件洗脱程序:初始流动相∶乙腈∶水(5∶95)经15 min梯度洗脱变化至100 %乙腈, 继续洗脱17 min ;体积流量1 .6 m L/min ;柱温:25 ℃;检测波长254 nm ;进样量20 μL , 利用外标法进行定量分析。

衍生化处理准确称取等量的2 , 4 -二溴苯乙酮和18 -冠-6醚配制成一定浓度的衍生化溶液, 置于4 ℃条件下避光保存;分别称取肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸和亚油酸0 .164 、0 .333 、0 .772 、0 .286 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至100 mL 待用。取上述脂肪酸标准溶液0 .15 mL 于具塞反应管中, 加入相应浓度的衍生化试剂3 mL , 另加入0 .4 g 碳酸钾已形成pH值为8 .3 ～ 8 .5 的缓冲体系。混合物于80 ℃水浴中加热30 min , 反应液置于4 ℃条件下冷却1 h , 过0 .45 μm滤膜后, 待HPLC 分析。准确样品0 .15 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至10 mL, 加入1 g 无水硫酸

钠脱去酶解物中的水, 4 200 r/min 离心5 min , 取上清液0 .15 mL , 按上述中脂肪酸标准品衍生化步骤处理, 所得样品待HPLC 分析。

统计分析选用OriginPro 7 .5 软件(OriginLab Corporation ,Northampton , USA)对数据进行单边方差分析(ANOVA)。显著性分析采用LSD 检验, 显著性水平采用0.05 。