[科普中国]-多位点序列分析

原理

多位点序列分析（MLSA）方法不使用分配的等位基因，而是将持家基因的基因片段序列连接在一起，并使用此连接序列，以确定物种系统发育关系。多位点序列分析方法采用多个保守基因位点进行鉴定分型，保守基因的选择对鉴定分型的结果至关重要。不同的基因由于进化速速率及进化时间的关系，有效的信息位点不一，其分辨力存在差异，为此，研究者创新性的将基因序列进行串联，增加有效信息位点数量，以便提高分辨力对难以区分的相似菌群进行鉴定，这一方法被称之为多位点序列分析（MLSA）。这一方法得益于多位点序列分型方法的快速发展，是近些年用于鉴定争议菌株的有力工具。1多位点序列分析方法具有快速简便、重复性好、高区分力的特点。同时，开发共享的多位点序列分析互联网数据库和高速发展的 PCR 测序技术优势使该方法逐步被广泛的应用于病原菌的鉴定分型研究中。

与多位点序列分型不同，多位点序列分析法的序列之间的高相似性由单个核苷酸差异决定，序列之间的低相似性显示多个核苷酸差异，因此，这种分析方法更加适用于具有克隆进化的生物体，不太适用于经常发生重组事件的生物。也可用来确定密切相关的物种之间的系统发育关系。

细菌基因在进化过程中的自然变异使得菌种鉴定研究者可以根据变异信息对菌株进行区分，然而不同的基因位点进化的速率有所差异，变异率大的基因能够更好的区分菌种，然而细菌的快速繁殖及自由频繁的信息交换使得基因获得了更大的变异，一些基因位点的同源片段重组使得其辨别力降低，不能很好的鉴别发生同源重组的菌种，为此，研究者们在应用多位点序列分析法进行分析时，将用于鉴定分型的基因序列进行串联拼接，增加了有效变异位点的数量，同时降低重组事件带来的影响。

应用多位点序列分析大量应用于研究不同的抗生素抵抗株、毒力或抗原的相关特殊基因型，以及新变异株引起的疾病流行病学研究。

2009年，Yoshizawa 等通过 MLSA 方法的分析发现，4 株分离自海水环境的发光弧菌在进化上归为哈维弧菌类似群菌株，但是又形成两个独立的分支，研究者将其分别命名为 Vibrio azureus sp. nov.和 Vibrio sagamiensis sp. nov.。22010年，Cano 等利用 5 个基因（rpoA、pyrH、 topA、ftsZ、mreB）对 2 株分离自澳大利亚昆士兰州养殖患病的白须龙虾（Panulirus ornatus）和斑节对虾（Penaeus monodon）的分离株进行分析发现，这两株分离株区别于其它已知的哈维弧菌类似群菌株，并提议将其命为新种 V. owensii sp.nov.。32013年，Wang 等应用该方法成功的鉴定出 2011 年 5-7 月在福建漳浦养殖的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）暴发的弧菌发光病病原为坎氏弧菌。4此外，研究者们通过多位点序列分析的方法分析已经发现分离自不同海洋深度的海绵弧菌分离株与近海岸的弧菌分离株是一个存在基因重组的随机交流群体。

2014年，上海海洋大学冯娟实验室利用多位点序列分析法对采集自 2007-2012 年我国南方沿海地区患病海水鱼的哈维弧菌分离株进行鉴定分型，为该类似群菌株引起的病害防治及流行病学调查提供了研究基础，研究了多基因位点序列对哈维弧菌类似群的区分力及哈维弧菌分离株多基因位点分型情况，证明多位点序列分析是区分具有表型和基因型高相似度的哈维类似群菌株的有效方法。此研究也发现，最新命名的哈维弧菌类似群成员 V. communis为首次在国内被发现为海水鱼病原菌，该两株菌分别采集自 2011 年广东流沙湾养殖的篮子鱼（149DEJ）和卵形鲳鲹（155DEI）。5