[科普中国]-透析平衡结晶法

定义

透析平衡结晶法1，亦称膜结晶法，是用半透膜隔开蛋白质溶液和结晶剂，通过膜蒸馏逐渐脱去蛋白质溶液中的溶剂分子，使得蛋白结晶溶液浓度缓慢升高达到亚稳区状态，从而产生蛋白质结晶的技术。常用的透析设备有透析管和微量透析纽扣。

特点与常规结晶技术相比，膜结晶技术具有结晶速度快、起始浓度低、诱导时间短、过程可控等优点，且可以更好地、更方便地控制晶体结晶过程，得到质量更好的晶体。此外，膜表面还可以起到非均相成核的作用。膜结晶过程的多功能性，使研究者可以在较短诱导时间内得到质量完美的生物大分子晶体。可以预言，膜结晶作为一种新兴的结晶分离技术，在蛋白质的结晶方面拥有较好的潜力和较大的应用前景2。

但是，透析结晶限制了诸如聚乙二醇（PEG）等结晶剂的使用，因为PEG吸出透析袋内水分的速度远大于其渗入膜的速度，从而导致袋内蛋白质产生沉淀3。

技术改进普遍认为膜蛋白很难在水性环境中保持活性，而平衡透析法可以为膜蛋白质的结晶提供一个疏水的环境来维持其活性，因此平衡透析技术被广泛应用于膜蛋白质的结晶。有研究者提出选择脂质立体中间相做介质来提高膜蛋白质的可结晶性。但是这种膜粘性较强，不易操作。

为解决上述问题，发明了一种膜引，是一种由清洁剂和脂质形成的双分子层，这种膜在温度低的时候处于液体状态；而当温度升高的时候，膜就变为粘性比较强的胶状固体。膜不仅可以为蛋白质提供疏水环境，而且从双分子层中收获晶体也变得简单易行。但是膜蛋白因为存在表达量比较低和容易形成聚集体等问题，目前其对晶体的研究尚处于起步阶段，有待发展更先进的技术来提高筛选成功率。

另一种微透析方法，将蛋白质溶液注射到一个毛细管中，毛细管覆有透析膜，膜可用塑料管套紧。对蛋白质溶液进行简单离心，然后用铸模粘土将毛细管封闭，接着将毛细管放入含有透析液的管中。

影响因素影响蛋白质结晶的因素大致可分为物理因素、化学因素以及生物化学因素等。物理因素包括温度、电磁场和压力等外界条件；化学因素包括溶液浓度、pH值、过饱和度以及离子强度等溶液环境；生物化学因素包括蛋白质结构、对称性、均一性以及等电点等。

温度温度能够通过改变蛋白质的溶解度影响结晶过程4。蛋白质在高温下的溶解度随结晶过程是由焓驱动或熵驱动决定。温度能够影响蛋白质侧链的酸碱平衡常数，氨基酸残基侧链电离基团的pKa与介质的离子强度关系非常密切。蛋白质在低离子强度介质中溶解度随温度升高而升高，在高离子强度时则降低。温度因素一般用于筛选优化结晶条件和生长高质量晶体。目前的温度筛选策略有最佳温度筛选策略、即时控制温度策略、衡量过饱和度法及循环温度策略。

样品纯度和均一性蛋白质样品的纯度和均一性是蛋白质结晶非常重要的两个因素。纯度可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱测定。蛋白质的二级结构可以使用傅里叶变换红外分光法和红外圆二色谱法测定。样品均一性可通过动态或静态光散射（SLS）测定。SLS测定均一性时，通过分析透射光强度可获得蛋白质分子的摩尔质量。SLS可检测蛋白质样品的质量及溶液聚合状态。

沉淀剂能够降低蛋白质溶解度的化合物被称为沉淀剂。沉淀剂通过3种机理发挥作用：改变水分活度、改变溶剂的介电常数和增强空间排阻。不同作用机制的沉淀剂之间互换性很小。不同的沉淀剂在结晶过程中可能会产生协同作用，最终促进蛋白质晶体生长。

pH值蛋白质中的氨基酸残基侧链含有大量的可电离基团，因此体系pH值的微小改变可导致蛋白质溶解度的变化。pH值可改变蛋白质大分子间盐桥和氢键的数目和作用力，这两种键对形核和晶体生长起着至关重要的作用。静电相互作用在蛋白质分子的特异性结合，蛋白质水合作用及与小分子、离子相互作用方面起着重要作用。一般地，能够保持蛋白质天然折叠状态的pH值更有利于促进蛋白质晶体的形成。

电场使用高压电场可以控制晶核的形成和结晶热力学过程。通过控制电流、电压、频率及电极材料等可以控制晶体形核数量以有利于产生高衍射质量晶体。溶液pH可导致蛋白质带电性质的不同，因此形核可发生在阴极或者阳极。电场对形核速率的影响与液相、固相之间的介电常数差异有关。离子强度越大电场的影响也就越大。

应用2006年，Ma5课题组用中空纤维微孔疏水膜对溶菌酶进行了结晶，并研究了沉淀剂和添加剂对结晶的影响，结果发现，微孔疏水膜作为非均匀成核的表面，不仅减少了结晶的诱导时间和初始蛋白质的浓度，而且可以更好地控制结晶的过程。以NaCl和NaSCN为沉淀剂，加入甘油、PEG4000、PEG6000等物质，有利于缩短晶体培养的时间，得到更大的溶菌酶晶体。

2008年，Zang等用聚偏氟乙烯中空纤维微孔膜对溶菌酶结晶的各种影响因素进行了系统的研究，研究发现，蛋白浓度、洗脱液的浓度和流速、沉淀剂浓度、结晶溶液的流速、pH值、结晶溶液的离子强度等都对晶体的形成和晶型有影响。2010年，该课题组又以木瓜蛋白酶为对象，采用动态膜结晶技术，得到了较大尺寸的木瓜蛋白酶晶体6。