[科普中国]-蛋白质体外定向进化

研究背景

1859 年，达尔文在《物种起源》中提出了生物进化论学说，揭示了生物在遗传、变异、生存斗争和自然选择中是不断发展变化的．近代生物学的发展使人们认识到蛋白质进化大多是由于某些点突变或修饰的积累，而在自然条件下，蛋白质性质或功能的改变通常需要很长时间．早期人们采取了各种诱变手段以期能够对蛋白质性能进行改造，如最早在1982 年，Winter 等报道了通过基因定位诱变获得改进的酪氨酸tRNA 合成酶．1983 年，Ulmer 在《科学》(Science) 上提出蛋白质工程(protein engineering)一词，指按照人们的需求，通过对蛋白质信息和功能的分析，设计改造蛋白质分子．但当人们试图基于蛋白质结构对其进行改造时，由于结构生物信息的匮乏以及蛋白质结构的复杂性，合理设计进行得十分困难，蛋白质工程的发展受到了严重制约。

蛋白质体外定向进化的发展拓宽了蛋白质工程的设计范围，可在未知目标蛋白质结构信息和作用机制的情况下对蛋白质进行改造。蛋白质体外定向进化发展初期，科学家主要将其用于筛选和控制(或影响)所需表型．20 世纪中期，蛋白质体外定向进化被引入实验室用于再现和研究自然进化进程．近年，定向进化更多地被用来改善蛋白质性能，改进蛋白质药物的稳定性、半衰期、免疫原性，开发酶的新底物利用以及改进或拓展新的代谢途径等。最近的研究表明，蛋白质体外定向进化被成功地应用在代谢途径的关键酶设计、新底物催化功能的开发、创造全新功能蛋白质以及筛选和鉴别预期功能蛋白质中，在代谢工程和合成生物学领域发挥了重要作用1。

主要方法在体外分子定向进化策略中,两个最关键的环节是构建目的基因的突变体库和对不同突变基因表达的蛋白进行筛选。在构建分子多样性最广泛的突变体文库方面,通常采用的方法是随机突变和体外重组。在定向进化的实践中,对不同的目标基因通常应选择合适的方法,也可以将二者结合起来运用。目前常用的技术有易错PCR、DNA改组、交错延伸重组、体外随机引发重组等23。

易错PCR易错PCR （error-prone PCR） 是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配， 导致目的基因随机突变， 然而， 经过一次突变的基因很难获得满意的结果， 由此发展出连续易错PCR （sequential errorpronePCR）， 它是将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板， 连续反复的进行随机诱变， 使每一次获得的小突变累计而产生重要的有益突变。

在该方法中， 遗传变化只发生在单一分子内部， 属于无性进化（asexual evolution）， 和其他进化方法相比较， 它消耗精力和时间， 一般适合较小的基因片段（