[科普中国]-乙酰乳酸脱羧酶

基本性质

α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase, α-ALDC)是酵母中 2, 3-丁二醇合成途径第二步催化反应的关键酶，也是 α-乙酰乳酸分解代谢流向缬氨酸、亮氨酸的生物合成关键调控点。尽管不同来源的α-乙酰乳酸脱羧酶分子量及理化特性有所不同，但是大多数微生物合成的 α-ALDC 由两个大小相同的亚基组成，分子量约为 20~40 kDa，pI 值为 4.7左右，最适 pH 在 5.0~7.0 之间，最适反应温度约为 40 ℃1。

基因特点各种细菌来源的α-乙酰乳酸脱羧酶基因同源性差异很大，通过分子生物学软件对GeneBank上的一些序列进行同源性比较：Bacillus subtilis和Coxiella burnetii之间48%；Bacillus subrilis和Bacillus licheniformis之间49%；Bacillus subtilis和Lactococcus lactis之间54%；Coxiella burnetii和Bacilluslicheniformis仅有15%；Coxiella burnetii和Lactococcus lactis 之间20%，Bacilluslicheniformis和Lactococcus lactis之间为20%2。

对枯草芽饱杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因alsD分析，其中有5个编码精氨酸的大肠杆菌的稀有密码子：1个CGA密码子，编码第3个氨基酸残基；另外4个AGA密码子分别编码第124、142、170和226位的精氨酸残基。枯草芽抱杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因alsD是处于一个叫alsSD的操纵子下游的基因。alsSD操纵子约4.5 kb，由als操纵子调节蛋白基因口括尺，乙酞乳酸合成酶基因alsS和a-乙酰乳酸脱羧酶基因alsD串连组成；在aIsR和alsS之间有两个彼此分开的核糖体结合位点(RBS)，在alsS和alsD之间有一个核糖体结合位点(RBS)，alsD后面串联着该基因的终止子3。

在乳酸乳球菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因aldB，它是leu-ilv-ald操纵子的第2个基因，编码3种支链链氨基酸(BCAA)残基亮氨酸、异亮氨酸和撷氨酸的合成。该基因在细胞中起到双重作用①催化乙偶姻途径的第二步反应。②控制亮氨酸和撷氨酸合成过程中α-乙酰乳酸池。它转录可以从Ieu基因和ilv基因的启动子(P1和P2)开始，或者从自身启动子(P3)开始4。

筛选了Leuconostoc oenos的基因组文库,得到了编码α-乙酰乳酸脱羧酶基因的alsD基因,该基因翻译为239个氨基酸残基。研究表明筛选到的片断转录为alsS和alsD基因，表明这两个基因位于同一个操纵子中2。

可以推测α-乙酰乳酸脱羧酶基因在微生物的基因组可能有相同或者相似的组织形式。

作用机理α-乙酰乳酸生成乙偶姻的方式有两种：一种是先经过非酶促氧化脱羧生成双乙酰，双乙酰再经过双乙酰还原酶的催化生成乙偶姻，该方式反应速度慢，且会生成双乙酰；另一种是通过 α-ALDC 的催化直接生成乙偶姻和二氧化碳，该方式反应速度快，且能够避免双乙酰的形成1。

在啤酒工业中的应用双乙酰双乙酰(diacetyl)是啤酒发酵中的风味物质，但是啤酒中双乙酰含量超过0.15 mg/L 时就能产生令人不愉快的馊饭味，严重影响啤酒的风味，国家标准(GB4927-2008)规定优级啤酒中双乙酰含量不得高于0.10 mg/L5。

在啤酒发酵过程中，已经研究清楚的酵母代谢生成双乙酰的途径主要有两种：一种是由羟乙基硫胺素的焦磷酸盐与乙酰辅酶 A 直接缩合得到，另一种是由 α-乙酰乳酸经非酶促氧化脱羧得到。酵母合成缬氨酸必须先生成中间产物 α-乙酰乳酸，而 α-乙酰乳酸在酵母中的合成代谢要快于分解代谢，这使得它在酵母细胞中逐渐积累。当积累量达到一定程度时，一部分被分泌到啤酒发酵液中，这部分 α-乙酰乳酸会进一步生成双乙酰，这无疑会给双乙酰含量的控制带来很多困难。因此，控制 α-乙酰乳酸的生成量也成了控制双乙酰含量的一个重要因素1。

α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒发酵中的应用为了在不增加设备投资的前提下，缩短啤酒生产周期以达到提高效益的目的。可以通过一系列的方法来控制啤酒中的双乙酰含量，例如选育低产 α-乙酰乳酸菌株，选育高α-乙酰乳酸转化率菌株，或者改进生产工艺等。当然，也可以直接在发酵过程中添加α-ALDC 来减少啤酒中的双乙酰含量。

1983 年，Godtfredsen从一株地衣芽孢杆菌中分离纯化出α-ALDC，将所得α-ALDC添加到啤酒发酵过程中，结果发现，添加 α-ALDC 会使啤酒发酵的成熟期缩短到 6 d 左右。1986 年，丹麦嘉士伯研究中心研发了一种以 α-ALDC 作为啤酒后熟助剂的先进啤酒发酵工艺，该工艺在 7 d 后熟和发酵时间内，酒液中的双乙酰含量明显低于阈值，且α-ALDC 酶制剂对酵母的发酵活力和速率没有不良影响。陈炜将 α-ALDC 用于啤酒主发酵和后发酵试验，结果表明，α-ALDC 对降低主发酵和后发酵啤酒中的 α-乙酰乳酸和双乙酰均有一定效果，对后发酵的作用效果尤为显著。也有研究发现，如果开始发酵时，在冷却麦汁中加入比例为 2 ppm(活性单位为 2000 U/mL)的 α-ALDC，满罐 5~6 d，可使啤酒发酵时间将缩短 7 天以上，且在过滤到成品啤酒的过程中，双乙酰的含量不出现回升现象。此外，大量研究表明，使用添加 α-ALDC 的方法来控制双乙酰不会改变啤酒的风味。丹麦的诺和诺德公司采用重组枯草芽孢杆菌生产出了 α-ALDC 制剂 Maturex L，并将该酶制剂进行了商品化销售，但其价格比较高，中、小型啤酒厂难以接受。凌建华比较了进口α-ALDC 和国产的α-ALDC，结果发现国产α-ALDC 的使用效果也很可靠，可替代进口同类制剂，但是同样面临着价格偏高的问题。因此，选育新型 α-ALDC 高产菌株，通过基因工程等手段提高 α-ALDC 产量以降低生产成本显得尤为重要1。

α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达研究为了获得更多的 α-ALDC，除了从自然界筛选获得高产的 α-ALDC 产生菌外，还可以将 α-ALDC 基因克隆到模式菌株中，构建基因工程菌进行过量表达。上世纪八十年代开始，就有许多国外学者克隆了不同来源的 α-ALDC 基因并进行不同载体的表达。

Fujii从产气肠杆菌中克隆得到 α-ALDC 基因，并将其连接到质粒 YIP 上，转化酵母受体菌 IP00751，将 α-ALDC 基因克隆并整合到受体菌的染色体上，最终获得的转化菌株的 α-ALDC 基因在非选择条件下能够保持稳定。Sone 等人克隆了产气肠杆菌中的 α-ALDC 基因，并分别在大肠杆菌和啤酒酵母细胞中表达，结果显示，转化子每毫克蛋白含 2 到 3 个 α-ALDC 酶活单位。Goelling也用利用筛选表达文库的方法，从一株链球菌中克隆得到 α-ALDC 基因，并证明该基因位于 1.3 kb 的 DNA片段内。国内对 α-ALDC 克隆表达的研究工作起步较晚，但近些年发展迅速。目前有许多来自不同细菌的 α-ALDC 基因己被克隆表达，如地衣芽饱杆菌、枯草芽抱杆菌、乙酰短杆菌、醋酸杆菌、短芽抱杆菌和产气肠杆菌等。选用的表达体系多为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌以及酿酒酵母等。郑晓东用 PCR 方法扩增产气肠杆菌的 α-ALDC 基因，得到 0.78 kb 的 DNA 片断，选用载体 pQE30 在大肠杆菌中高效表达，获得的酶活性可达 180U/mL，重组菌株稳定性较高，在 37 ℃连续培养 67 代仍能够保持酶活性1。

α-乙酰乳酸脱羧酶的酶学性质研究工业中使用的酶制剂多为纯酶，而纯酶的酶学性质和粗酶的酶学性质具有很大差异。因此，在获得粗酶的基础上，对其进行纯化并研究纯酶的酶学性质具有非常重要的意义。

早在 1970 年，Loken就研究了从产气气杆菌中提取纯化的 α-ALDC 的酶学性质，结果显示，该酶的最适 pH 值为 6.2~6.4，金属离子对该酶有不同程度的抑制作用。1985年， Rasmussen利用 FPLC Mono Q 柱层析和 Fractogel DE 650S 阴离子交换柱提纯干酪乳杆菌产生的 α-ALDC，研究该酶的一些基本的酶学性质发现，该酶含有两个相同的亚基分子(分子量为 24, 000)，等电点为 4.7，最适 pH 值为 5.0~6.0，最适温度为 40 ℃。该酶的稳定性较差，37 ℃、pH 5.0 条件下的半衰期只有 15 min。而 Godtfredsen研究发现，乳链球菌 α-ALDC 的活性较高，稳定性也很好，但溶解性较差，会给后处理带来困难。大量的关于 α-ALDC 酶学性质的研究发现，不同来源的基因所表达 α-ALDC 在酶学特性有一定的差距，即使来源于同一个菌属，在菌种不同或培养条件不同时，所表达的α-ALDC 的酶学特性也不尽相同1。