[科普中国]-诱导性表达载体

表达载体主要有自主复制质粒、整合质粒和噬菌体三种。第一代主要来自金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌，通过重组构成带有双抗性标志的嵌合质粒被广泛应用。第二代质粒载体是穿梭质粒，如大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，可以在大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统中都可以表达外源蛋白。第三代质粒表达载体是嵌合质粒。对于一些外源蛋白的表达，为了提高表达效率，可对表达载体进行改造，就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件，使目的基因能够表达的载体，在表达载体中引入严格调控的强启动子，通过不同的诱导方式，如环境诱导，化学诱导等，来实现外源蛋白的高效表达。启动子对外援基因的表达至关重要，它由两段核甘酸序列构成， 即-35 区的 TTGACA 和-10区的 TATAAT，启动子控制转录的起始位点，并影响转录效率。强启动子还能抑制其它蛋白的表达，从而降低了菌体释放蛋白酶的可能性， 并有效避免了菌体自溶。启动子能活化 RNA 聚合酶，使之与模板 DNA 准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子是实现外源基因高效表达的关键。

常用的诱导型启动子1优良的分泌能力是枯草芽孢杆菌作为工程菌的一大优势。 有研究表明，在其菌体生长的对数晚期，会向胞外分泌自身产生的蛋白酶， 这在大程度上影响外源蛋白的积累。 枯草芽孢杆菌的这一缺陷可以通过构建诱导型表达分泌载体来弥。葡萄糖诱导系统和蔗糖诱导系统是枯草芽孢杆菌常用的两种诱导体系。

诱导性表达载体的诱导方式诱导型启动子可根据需要在特定的诱导条件，快速诱导基因转录的“开”与“关” 。诱导型启动子可以分为两类：一类与环境应答有关，如渗透压、pH 值、氧气匮乏、低温、热休克等，在这些环境下，启动子启动相应基因转录，以适应环境变化；另一类是化学诱导启动子，即受化学诱导物诱导而提高相应基因的表达量。下面主要介绍枯草芽孢杆菌中常用的几个化学物诱导启动子。枯草芽孢杆菌中最常见的是受 IPTG 诱导的启动子，IPTG 能够与大肠杆菌的转录阻遏蛋白 LacI 结合，使得 LacI 从操纵位点上脱离，从而诱导下游基因的表达。最早应用的是启动子 Pspac，由枯草芽孢杆菌噬菌体 SPO1 和大肠杆菌 lac 操纵子融合而成。枯草芽孢杆菌中第 2 个启动子系统是以木糖为诱导物的启动子 Pxyl。Pxyl 由 xylR 编码的阻遏蛋白严格控制表达，通过添加 0.1%-2% 的木糖，能够诱导该启动子的表达，木糖启动子系统对代谢中的大部分代谢产物不敏感，不过却受到葡萄糖的抑制。枯草芽孢杆菌中第 3 个启动子系统是以蔗糖为诱导物的 sacB 启动子，sacB 基因是枯草芽孢杆菌基因组上受蔗糖诱导调控的基因，编码外分泌的蔗糖果聚糖酶（Levansucrase） 。其启动子 sacR 转录起始是持续性的，不受蔗糖诱导的控制，但在无蔗糖的情况下，其表达强度比有蔗糖诱导时低 100 倍2。

诱导性表达载体的类型葡萄糖诱导系统，蔗糖诱导系统和木糖诱导系统这3 个启动子诱导系统在枯草芽孢杆菌中应用广泛，尤其是前两个系统，常被用做外源蛋白高效表达的元件，但它们共同存在一个缺点就是所用的诱导物 IPTG 和木糖价钱昂贵，在工业生产中易增加成本，因此限制了在工业生产中的应用。而蔗糖诱导启动子的启动强度相对较弱，无法在工业生产中高效表达目标蛋白。在食品级乳酸菌中已经形成了一系列适合乳酸菌的基因表达系统，例如：糖诱导表达系统，噬菌体Φ31爆发式诱导的表达系统、乳链球菌素调控表达系统、 pH值调控表达系统等3。

糖诱导表达系统乳酸菌基因组中含有糖代谢相关基因簇，在以各种糖类为碳源的培养基上生长。在乳酸菌的糖诱导表达系统中，主要应用的是糖类选择标记。糖类作为食品级诱导物，可以作为非抗生素抗性的选择标记进行应用。大多数表达系统使用乳糖作为选择标记来诱导基因表达。在乳糖选择系统中，将糖类筛选标记进行克隆，构建食品级载体。

乳链球菌素调控表达系统在乳链球菌素调控表达系统中，应用了细菌素抗性选择标记。细菌素是细菌在代谢过程中产生的一种具有抗菌特性的蛋白质，菌体本身对细菌素具有免疫性。常用的食品级细菌素为乳链球菌素，又名乳链菌肽（ Nisin），此食品级诱导物控制的基因表达系统为NICE基因表达系统。

pH值调控表达系统Madsen等通过研究发现了受pH值调节的启动子P170，构建了表达载体pAMJ529、 pAMJ536和pAMJ547，转化后发现，当pH值为5.5时，菌株能够生长，当上调至7.0时表达受到抑制，停止生长。通过调节不同的pH值，进行调控系统的诱导表达。

诱导性表达载体的应用诱导性表达载体已经成功的应用于酶、多肽、中间代谢物等表达产物的生产，对食品、医药、保健业和工业等领域大发展起到极大的推动作用。通过利用强启动子将克隆基因整合到染色体上，构建高效的诱导性表达载体，通过不同的诱导方法，实现外源蛋白的高效表达。