[科普中国]-疏水色谱分离技术

历史研究

关于在疏水色谱分离技术进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，“疏水作用”一词是Kauzmann于1959年首次在“蛋白质进展”杂志中提出的，随后陆续有学者发表用疏水层析成功分离蛋白质的文献报道；如钙调蛋白、苯丙氨酸裂解酶、凝集素等。该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。1972年，Erel Z.等人将不同链长的α，ω-二胺同系物键合在琼脂糖上，以不同pH的含盐缓冲液作流动相成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子的重要作用。此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）1。

概念与原理疏水色谱分离技术是利用样品中各组分具有不同的疏水作用的性质进行分离，主要分离对象是蛋白质。疏水作用色谱固定相的非极性比较弱，流动相多采用高浓度盐缓冲液进行梯度洗脱。温和的分离条件，可以避免反相色谱中由于固定相较强的疏水性和有机流动相引起蛋白质的不可逆吸附和变性，因此特别适用于活性物质的分离与纯化。疏水作用色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性 配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先流出。在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的组成使蛋白质得到分离2。

疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品。目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段1。

填料研制和开发新型的色谱填料仍是HIC 发展的技术核心。从疏水色谱填料的基质来看, 填料包括无机和有机填料两种。

无机填料: 无机填料中, 硅胶在HIC 应用较广泛, 其优点是机械性能好, 孔结构和表面积易于控制, 并有较好的化学稳定性。但硅胶的pH 值应用范围较窄( 2. 0~ 8. 0) , 且硅胶表面上的硅羟基可对蛋白质产生不可逆吸附。另外, 硅羟基的解离可使填料具有阳离子交换性质, 使分离产生混合机理。

近年来, 多用高分子涂层硅胶填料替代单纯硅胶填料。这种填料选用合适的聚合物、寡聚物或单体, 在硅胶表面形成致密的聚合物涂层, 使其既具有高聚物的化学稳定性, 又具有硅胶基质的高机械强度。

有机填料: 在有机物填料中, 多聚糖( 如琼脂糖) 最常用, 它具有表面基团丰富、pH 使用范围较宽及与生物大分子良好的相容性等优点, 但其机械强度不能用于高压疏水色谱。另外, 在与配基偶联时,常需剧毒CNBr 活化, 且工艺较复杂。近年来, 有学者尝试用壳聚糖为基质研制疏水色谱填料, 并成功用于A-淀粉酶、鸡卵类黏蛋白的分离纯化。疏水色谱填料配基的一个重要特征是具有弱疏水性, 与蛋白质作用温和, 从而能保证蛋白质的生物活性不丧失。疏水色谱填料配基密度较低, 碳链长度一般在C-Cs 之间。烷基、苯基是常用的HIC 填料配基。如果结合力过强, 蛋白质难以洗脱, 需用一些高离液序列盐类( Chaotropic salt) 或有机溶剂洗脱,但此时蛋白质易丧失生物学活性 34。

操作过程介质的选择在HIC中，应选机械强度较大的刚性基质；若待分离物质分子量很大，且样品量较大，则应选大孔基质，如琼脂糖凝胶；若待分离物质较小，或样品量很小，但分辨率的要求高，则可选孔径小的基质甚至非孔型基质。

HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8之间，苯基的疏水性大致与戊基相当，因与溶质发生π-π相互作用，它与戊基有不同的选择性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基与苯基之间 。

样品的准备往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与流动相A（平衡液）中基本一致，并调节样品溶液的pH使其满足吸附条件 ，同时选择适当浓度及pH的缓冲液。

HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样。

层析条件的优化

优化目标：

目标分子达所需纯度的基础上，获得尽可能高的回收率，同时力求缩短分离所需时间、降低分离成本。

HIC中，层析条件包括流动相A，流动相B，洗脱方式，层析柱的柱长，流速，温度等 。

流动相A的缓冲液的种类、pH ，盐的种类和浓度的选择：

缓冲液种类据所需的pH选择，注意目标物的稳定性，浓度一般在0.01--0.05mol/L；

不同盐类对疏水作用的强度有影响，层析中的选择性也不尽相同；盐浓度也随目标分子的疏水性而异，(NH4)2SO4常用0.75～2mol/L，NaCl为1～4mol/L；

流动相B为含盐量较低的缓冲液，缓冲液类型与流动相A一致。

洗脱的方式：

采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；

通过往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱 （溶剂中稳定性良好的物质）；

往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）。

洗脱理论：

疏溶剂理论：1976年由Sinanoglu等人提出，认为由于溶质分子有减少其与水接触的非极性表面的倾向，而增加了与疏水配基结合的概率。

自由能分离理论：1979年Vanoss等人提出，认为生物体界面自由能比水低，与配基产生范德华力，这个引力随溶液盐析能力的改变而改变。

熵分离理论：1984年Regnier提出，认为高盐溶液中，蛋白质疏水区域的邻近分子是有序排列，疏水部分易于配基结合，减弱了水分子排列的有序度，表面水分子被排斥开，使体系熵增加2。

层析介质的再生、贮存再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微生物钝化灭活起到消毒的效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的清洗剂。

贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微生物的生长5。

影响因素盐类和盐组成盐的摩尔表面张力增大，蛋白质在疏水层析柱内的吸附能力相应增大。各种盐离子和离子对具有破坏周围水分子有序排列的能力。 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的吸附能力具有最为重大的影响。选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋白质的活性都很重要。硫酸铵、醋酸铵、氯化钠和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。

离子强度离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的保留值。一般增加离子强度来增加组分的保留值，降低离子强度来提高组分的解析附能力。

HIC实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。

溶液的酸碱度溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境。一般情况，溶液的pH接近蛋白质的等电点，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作用；远离其等电点，其疏水性减少，不利于与固定相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变溶液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。

柱温一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高层析柱的分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作5。