[科普中国]-酶的包埋法固定化技术-

原理

包埋法制备的固定化酶可防止酶渗出，底物需要渗入凝胶孔隙或半透膜内与酶接触。此法较为简便，固定化时一般不需要与酶蛋白的氨基醛残基起结合反应，酶分子本身不参加水不溶性凝胶或半透膜的形成，仅仅是被包围起来，因而从原理上而言，由于酶分子本身不发生物理化学变化，酶的高级结构改变较少，酶的回收率较高，适用于固定各种类型的酶。但由于只有小分子的底物和产物可以通过高聚物扩散，故包埋法日于小分子底物和产物的酶，对那些底物和产物是大分子的酶则不适合。而且高聚物网格或半透膜对小分子物质扩散的阻力有可能会导致固定化酶的动力学行为改变和活力的降低。

分类凝胶包埋法凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶，卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。

天然凝胶采用溶胶状天然高分子物质在酶存在下凝胶化的方法，包埋时条件温和、操作简便，对酶括性的影响甚少，但强度较差。合成的高分子则采用合成高分子的单体或预聚物在酶存在下聚合的方法。合成载体的强度较高，但需在一定的条件下进行聚合反应才能把酶包埋起来，聚合反应的条件往往会引起部分酶的变性失活，所以包埋条件的控制非常重要。如聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法，制备时在酶溶液中加丙烯酰胺单体和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺，在氮气的保护下，加聚合反应催化剂四甲基乙二胺和引发剂过硫酸钾等使其在酶分子周围进行聚合.形成交联的高聚物网络，酶分子便被包埋在刚聚合的凝胶内。

微胶囊包埋法微胶囊型包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。常用于制造微胶囊的材料有聚胺、火棉胶、醋酸纤维素等。

用微胶囊型包埋法制得的微囊型固定化酶的直径通常为几微米到数百微米，胶囊孔径为几埃至数百埃，适合于小分子底物和产物的酶的固定化，如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、过氧化氢酶等。此法需要一定的反应条件和制备技术，被包埋的酶不易流失。其制造方法有界面聚合法、界面沉淀法、二级乳化法、液膜（脂质体）法等。

（1）界面聚合法。此法是将含有酶的亲水性单体和化分散在与水不相溶的有机溶剂中，再加入溶于有机溶剂的疏水性单体。亲水性单体和疏水性单体在油水两相界面上发生反应，形成高分子聚合物半透膜，使酶被包埋于半透膜内。常用的亲水单体有乙二醇、丙三醇等；疏水单体有聚异氰酸酯、多元酰氯等。在包埋过程中由于发生化学反应，可能会引起某些酶失活。此法曾用聚脲制备天冬酰胺酶、脲酶等的微囊；

（2）界面沉淀法。这是一种简单的微囊化法，此法是利用某些高聚物在水相和有机相面上溶解度较低而形成皮膜将酶包埋。一般是先将含高浓度血红蛋白的酶溶液在与水不互溶的有机相中乳化，在油溶性的表面活性剂存在下形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油水上沉淀析出形成膜，将酶包埋，最后在乳化剂的帮助下由有机相转入水相。此法条件温和酶不易失活，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很困难。作为膜材料的高聚物有堆硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。此法曾用于固定化天冬酰胺酶、脲酶等。

（3）二级乳化法。该法是将酶溶液首先在高聚物有机相中分散成极细液滴，形成第一个“油包水”型乳化液，此乳化液再在水相中分散形成第二个乳化液，在不断搅拌下，低温真空蒸出有机溶剂，使有机高聚物溶液固化便得到包含多滴酶液的固体球为囊。常用的高聚物有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯化橡胶等，常用的有机溶剂为苯、环己烷和氯仿。此法制备比较容易，酶几乎不失活，但残留的有机溶剂难以完全去除，而且膜也比较厚，会影响底物扩散。此法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯制备成过氧化氢酶、脂肪酶等微囊；。

（4) 液膜法（脂质体法）。上述微囊法是用半透膜包埋酶液，近年又研究出以脂质体为液膜代替半透膜的新微囊法。脂质体包埋法是由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶的方法，此法的最大特征是底物和产物的膜透过性不依赖于膜孔径的大小，而与底物和产物在膜组分中的溶解度有关．因此可以加快底物透过膜的速率。此法曾用于糖化酶的固定化。