[科普中国]-空间蛋白质晶体生长

发展历程

正如众多科学家所认可的，21世纪是生命科学的世纪。探索生命的奥秘，对于改善人类健康和促进经济发展及社会进步都具有非常重要的意义。距离地球几百公里以外的空间具有显著不同于地面的环境。利用这样的环境开展的空间生命科学和生物技术研究是生命科学研究的一重要研究领域，可能为人类开发巨大的空间资源做出重要贡献。空间生物技术是上个世纪最热门的一项空间科学研究，并从多个方面进行了探索研究。空间细胞生物技术的发展令人十分关注，其主要目标是用于研究、移植和生产生物药物的细胞和组织工程。空间生物大分子生物技术则是另一个重要发展方向。2

当前绝大多数的生物大分子的三维结构是用X-射线晶体衍射方法解析而得的。由于生物大分子特殊的结构性质，该结构测定方法的第一个步骤一一生长晶体是最关键的步骤，也是最困难的步骤，能否生长出合用的、较高质量的蛋白质晶体是结构测定成功与否的关键。生物大分子晶体生长是一复杂的动态过程，受多种物理、化学和生物学因素的影响。其中，重力驱使的沉降和对流等现象也会影响晶体生长的质量。然而，在离地面几百公里的空间，重力水平只有地面的万分之几，甚至更低，我们称之为微重力环境。在这样的环境中生长蛋白质晶体，溶质对流和晶体沉降变得非常微弱乃至可以忽略不计，晶体处在稳定的溶液环境中保持原位生长，不再产生由重力导致的晶体堆集；此时，生长晶体周围由于晶体摄取溶质分子而形成的溶质贫乏层能够稳定地存在，而且厚度是地面上的几倍，这使得晶体能够在一个有利的环境中生长。溶液对流的消失还减少了杂质接近晶体的机会，使得晶体更纯正。另外，在空间微重力条件下，还可以很方便地实施无容器或无器壁接触的晶体生长，进而消除对晶体生长不利的器壁效应。因此，空间的微重力环境为蛋白质等生物大分子的晶体生长提供了理想途径。2

自 1981 年首次使用探空火箭得到 β-牛乳糖晶体至今的30 多年中,空间蛋白质的结晶研究取得了世人瞩目的成就,研发了诸多空间结晶装置 ,得到了数百种高衍射分辨率的晶体,解析或优化了多种具有重要生物学意义的蛋白质三维结构 ,为结构生物学和人类健康作出了重要贡献。

机理（1）常重力下对流与沉降对结晶的不良影响

重力矢量是影响蛋白质复杂结晶过程的一个重要因素 ,在分子水平上与分子间作用力同样重要 。它可在分子水平上影响键能 ,进而影响蛋白质相关的物理属性。

在常重力场下 ,溶液界面的温度和浓度梯度可引发浮力驱动的对流 。这种对流除了影响蛋白质分子正常有序的溶质传输过程外,其产生的扰动还会可破坏晶核周围稳定的溶质缺乏区,改变蛋白质与沉淀剂溶液的平衡速度,影响晶核形成和生长。在常重力场下 ,当晶核生长达到约1μm 时 ,晶核生长的主导作用由布朗运动转变为沉降作用 ,晶核会沿重力方向沉降至容器壁上继续生长 。晶体与容器壁相互作用 ,产生较大内应力 ,妨碍了晶体 1 个或多个晶面的生长 ,尤其是紧密接触器壁的晶面, 使晶体产生缺陷或扭曲。此外 ,沉降晶体之间可能会重叠或融合 ,由此产生大量缺陷晶体 。3

（2）空间微重力环境可消除或减弱对流与沉降对结晶的不良影响

空间微重力环境并非0g ,现泛指 10-3 ～ 10-9 g ,航天飞机或空间站上的重力水平可达到 10-3～ 10-6 g。这样的环境中 ,由于浮力驱动的对流和沉降可被消除或大大减弱,晶核形成和生长摄取蛋白质后会在晶核周围形成稳定的溶质缺乏区(Concentration-depletion zone ,CDZ)。从图 1(a)中可看到,空间微重力环境下晶体周围可形成稳定的溶剂化层和溶质缺乏区 CDZ 。从图 1(b)中可看到 ,常重力下对流和沉降破坏了二者的形成 。在空间和地基用毛细管和光学方法证实了 CDZ 的存在。CDZ 中蛋白质过饱和度远比母液中低,蛋白质分子被晶核捕获需要更高能量和更长时间 ,致使晶体生长速率变慢。由于浮力驱动的对流和沉降被消除或减弱,溶质分子的传输仅靠缓慢的扩散过程 ,大约为 10-6～ 10-7 cm2/s ,因此 ,蛋白质分子有充足的时间在晶格表面正确定位 ,有利于晶格的有序排列 ,从而可获得高质量的晶体。在低过饱和度的 CDZ 中形成新晶核需要更高能量 ,因此较难形成新晶核 。这样 ,溶液中的蛋白质主要用于原有晶核生长 ,不利于新晶核形成 ,从而减少了形核或二次形核的机会。

因为质量决定扩散速度 ,所以在没有对流和沉降干扰的情况下 ,分子质量较蛋白质大得多的杂质难以接触和结合到晶核上 ,减少了杂质引起蛋白质晶体缺陷的机会。在空间微重力环境下,由于对流被消除或大大减弱 ,晶体从形核到生长停止期间可静止悬浮在溶液中某一相对固定的位置 ,避免了来自容器壁的不良影响 。晶体在各个方向上的生长是自由的 ,有利于等方性生长,易于形成形貌统一的较大单体。这些机制能在一定程度上解释,在几乎无对流和沉降的空间微重力环境下生长蛋白质晶体, 晶体数目减少 ,尺寸增大 ,晶体形貌和衍射质量明显改善的现象 。凝胶介质中的蛋白质结晶研究结果也在一定程度上验证了对流和沉降对蛋白质晶体生长的影响 。3

（3）空间微重力环境可提高晶体衍射分辨率

微重力环境可通过改善分子间堆积模式,增加晶体短程有序性来降低晶体漫散射,而且还可通过增加晶体尺寸、降低晶体镶嵌度来增加晶体长程有序性,从而提高晶体衍射分辨率。

（4）空间晶体有序水分子数目的增多

微重力环境下蛋白质晶体质量的改善程度可能与晶体溶剂的含量相关。蛋白质晶体质量是由晶体内三维有序化程度决定的 ,而水分子对稳定晶体内分子有序排列起着重要作用 ,特别是由弱作用力维系的蛋白质分子周围的有序水分子。蛋白质晶体溶剂含量越高 ,空间微重力环境改善溶剂结构的可能性越大。与地基对照相比 ,空间晶体中有序水分子、氢键数目和水桥明显增多,且这种差异随着与蛋白质分子距离的增大而增大。这是空间微重力环境改善蛋白质晶体质量的一个重要因素 ,可能与常重力条件下对流可带走晶体表面的部分溶剂化层有关。3

研究成果对结构生物学的贡献利用X-射线单晶衍射技术解析蛋白质三维结构时,衍射分辨率越高 ,解析得到的三维结构就越精细,从而能促使人们更好地理解蛋白质的功能及作用机制。与地基对照相比 ,20 %以上的空间晶体衍射分辨率得到提高。通过对这些高分辨率的空间晶体进行 X-射线衍射分析,解析或改善了多种具有重要生物学意义的蛋白质的精细三维结构 ,为结构生物学和人类健康作出了不容忽视的贡献。1

对晶体生长的积极影响与地基对照相比 ,蛋白质在空间微重力环境下结晶时形核时间延长,形核及二次形核数目显著减少 ,在容器壁上的异相形核显著减少 ,晶体总生长速率降低,晶体尺寸显著增大 。空间晶体有更好的形貌和光学性质(如透明性、双折射性更好,杂质和缺陷更少)和更尖锐的布拉格反射 ,更低的漫散射, 衍射分辨率显著提高 ,镶嵌度降低。空间晶体结合有序溶剂分子或水分子比地基对照显著增多,B 因子降低,侧链的位置更确定,暗示空间晶体的热扰动和静态混乱更少。3

存在的问题与对策(1)结晶成功率偏低

目前 ,空间蛋白质晶体生长的总成功率仍然较低。一方面是因为目前对蛋白质晶体生长机理尚不明晰 ,装置设计还要受到航天器条件限制,因此结晶装置设计不合理 。另一方面是蛋白质结晶条件不合适。如果能研发出更科学合理的结晶装置 ,有望大幅度提高空间微重力环境下蛋白质结晶的成功率。

(2)马朗格尼对流的影响

在空间微重力环境中虽然对流和沉降可被消除或减弱,但是 ,在地基结晶中被掩盖的马朗格尼对流(Marangoni con-vection)会成为影响晶体质量的主要因素 ,尤其是在气相扩散法中。人们认为马朗格尼对流是早期广泛使用气相扩散法导致空间结晶实验成功率低的原因之一,应用逆向扩散技术可有效避免马朗格尼对流对结晶的影响 ,提高晶体质量。3

(3)实验机会受限 ,成本高昂空间蛋白质结晶受到航天器发射机会的限制 ,实验成本高昂。研发微重力环境地基模拟技术会提供一条较好的解决途径。

(4)研究手段缺乏

目前缺少的研究手段主要是蛋白质晶体形核阶段检测与分析技术和在轨结晶实验的自动化操作技术。

(5)微重力环境不稳定

航天器上的重力水平并不像人们之前设想的那样是静止不变的,而是随着宇航员的活动及相关仪器设备的运行而波动 。模拟计算和有限实验结果显示,加速度大于 1μg时 ,即可对晶体生长产生扰动 。

(6)震动的影响

航天器上产生的低频振动可引起结晶溶液中的晶体移动和液体流动 。研发的震动隔离装置可有效避免震动的影响 ,如微重力隔振技术手套箱等 。

(7)资助力度下降

在 20 世纪80 年代至今的30 多年中,尽管空间蛋白质晶体生长的研究已经取得了诸多令人欢欣鼓舞的结果 ,但是批评声始终没有停止过。目前西方发达国家对空间蛋白质结晶研究资助的力度已大幅下降 ,国外空间蛋白质晶体生长的研究陷入低谷 。3

未来的发展方向(1)新型结晶装置

根据通用、高效、便携、无源的原则研发了空间蛋白质结晶新装置。未来空间蛋白质结晶装置的两大发展趋势为结晶室容量大 、便携性好 ,结构简单实用和硬件结构模块化,系统多功能性。结晶装置的设计将更多基于逆向扩散技术, 以有效避免马朗格尼对流对结晶的影响。3

(2)新型监测技术

分析总结一些可用于蛋白质结晶监测的新技术 ,如监测溶液对流的条纹照相 、干涉法全息摄影术等 ;监测溶质传输速度的激光多普勒速度测量技术、颗粒影像速度测量技术等;监测结晶温度的物理探针、液晶温度仪等。

(3)搭载材料与次数选择

搭载材料应重点选择具有重要生物学意义且地基常规方法无法得到晶体或高质量晶体的蛋白质 。适当增加单种蛋白质的搭载次数可优化结晶条件,增加得到高质量空间晶体的机会。

(4)生长条件和生长时间的分隔控制

由于蛋白质分子的理化特性千差万别 ,如果能根据蛋白质的不同性质来设定生长条件 ,在轨分隔控制各种蛋白质晶体的生长过程,可增加得到高质量空间晶体的机会 。3

(5)增加凝胶的使用

凝胶可抑制对流, 促进蛋白质晶体的等方性生长 ,在运输 、航天器着陆 、冷冻等过程中保护晶体的光学和 X 射线衍射性能。

(6)加强机理研究

利用空间微重力环境探讨重力等因素对晶体生长的影响 ,使人们能更好地利用空间微重力环境资源,丰富蛋白质晶体生长理论体系 。

(7)地基模拟技术

由于空间蛋白质结晶的实验费用昂贵 ,实验机会受限等原因,人们研发了一系列地基技术模拟空间微重力环境, 用于蛋白质结晶研究, 如空气动力悬浮、液体界面悬浮、超声悬浮、静电悬浮、电磁悬浮及其组合应用。各种尺寸的毛细管和琼脂糖凝胶也可模拟微重力环境蛋白质结晶的研究。强磁场是目前最好的地基模拟技术手段之一。3

总体评价任何事物都是在曲折中前进的,空间蛋白质结晶研究也不例外。虽然目前对此类研究的批评声此起彼伏 ,许多发达国家研究资助的力度已大幅下降,国际空间蛋白质结晶研究陷入低谷 ,但是我们不能无视那些已取得的骄人成绩, 更不能因此而放弃它,空间蛋白质结晶的潜力还没有被完全开发出来,尤其是国内研究才刚刚拉开序幕。

未来 ,我国建立自己的空间站后就可以持续地研究空间蛋白质的结晶 ,尽快促使我国在这一研究领域赶超国际先进水平,有力促进国内空间生命科学的发展 。我们应该客观地看待其利弊,趋利避害,发现新问题, 总结新规律 ,更好地利用空间特殊环境优势, 发展一种具有普适意义 、能提高蛋白质晶体质量的方法,以解决 X射线单晶衍射技术解析蛋白质结构的瓶颈问题,促进结构生物学的迅猛发展。同时, 深入探索微重力及各种因素对蛋白质结晶的影响及其机理,丰富蛋白质晶体生长的理论体系。3