[科普中国]-葡萄糖异构酶

简介

葡萄糖异构酶(glucose isomerase , GI)，又称D-木糖异构酶(D-xy lose isomerase)。1957 年最早在嗜水假单胞菌中发现其活性，后来有近百种细菌和放线菌被鉴定为产GI 的菌株1，其来源非常广泛，细菌、真菌和放线菌等微生物以及植物和动物细胞中均有存在。

GI 是一种胞内酶，参与对进入体内的木糖的利用，其最适的天然底物为D-木糖2。后来人们发现，其在胞外可以将D-葡萄糖转化为D-果糖。应用这种酶可以使葡萄糖浆中朽% 以上的糖分转化为果精， 使甜度大大提高，从此，GI 被大量应用于高果糖浆( high fructose syrup，HFS) 工业生产中。

结构特点虽然不同种属来源的GI 的一级结构有一定的差异，但在空间结构上具有相似性。GIase 都是非糖蛋白，一般以四聚体或二聚体形式存在。其亚基单体分子质量为19 ～ 52 kD。四聚体亚基之间都以非共价键相结合，无二硫键，二聚体之间的结合力强于二聚体内的亚基间结合力，亚基单体间符合222点群对称分布，每个亚基单体分两个结构域3。N端的主结构域: 由8 股α /β 螺旋折叠结构围成具有催化作用的“催化口袋”，内层由8 条平行的β 折叠片构成，外层由8 股与β 折叠片交替相邻的α 螺旋构成，α 螺旋的肽链走向与β 折叠片成反平行，活性中心则位于β 折叠的近C 端口部。C 端的小结构域：由几段α 螺旋无规则卷曲成一个远离N 端的不规则环状结构，该结构域参与亚基间的相互作用及活性中心的构建。

四聚体葡萄异构酶有4 个活性中心，呈口袋状，活性中心位于亚基催化域β 桶的近C 端口部。每个活性中心由2 个相邻亚基构成，包含2 个二价金属离子结合位点，以及与底物结合和催化过程相关的保守残基。

生物学性质GI 它是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆的关键酶，且该酶可将木聚糖异构化为木酮糖, 再经微生物发酵生产乙醇。

热稳定性

乳酸杆菌和埃希杆菌GI 的热稳定性较差，链霉菌和枯草芽孢杆菌GI 在高温下相当稳定。嗜热高温菌(Thermus thermophi lus)GI 的热稳定性最高，可能是它对Val 及Pro 等氨基酸的偏爱选择,使其具有更紧密的空间结构1。

底物专一性

GI 除了D-葡萄糖和D-木糖外， 还能以D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-阿洛糖和脱氧葡萄糖以及葡萄糖C-3 、C-5 和C-6 的修饰衍生物为催化底物。但是GI 只能催化D-葡萄糖或D-木糖α-旋光异构体的转化， 而不能利用其β-旋光异构体为底物。

最适pH和最适温度

GI 的最适pH 通常微偏碱性， 在7.0 ～ 9.0 之间。在偏酸性的条件下，大多数种属的GI 活力很低，GI 最适反应温度一般在70 ～ 80 ℃。

金属离子的影响

GI 的活力及稳定性跟二价金属离子有重大关系，Mg2+ 、Co2+ 、Mn2+ 等对该酶有激活作用，Ca2 + 、Hg2 + 、Cu2+等则起抑制作用。金属离子还影响GI 对不同底物的活性，如凝结芽孢杆菌GI 和Mn2+结合时对木糖的活性最高， 和Co2+结合时对葡萄糖的活性最高。

作用机理GI的催化过程主要分为4个步骤：底物结合、底物开环、氢迁移反应（异构化）和产物分子的闭环，其中氢迁移反应被认为是整个反应过程的限速步骤。

烯二醇中间体催化机制

此催化机制首先提出底物是以开环方式与酶结合的。H54 作为碱性催化剂与底物C1 相互作用。底物O1 和O2 附近的水分子可能是起催化作用的酸，它使底物羰基极化从而促进烯二醇中间体的形成1。

负氢离子转移机制

晶体学和酶动力学的证据表明，GI 是采用金属离子介导的负氢离子转移机制。关于负氢离子转移中间体形式有两种看法，一种是阳离子形式， 在异构化过程中， Mg-2 极化底物C1 的羰基产生碳正离子， Mg-1 和K183 作为路易斯酸稳定碳正离子，同时两个金属离子稳定O2 的负电荷 。另一种是阴离子形式，提出与底物的O1 、O2和D257 的羧基形成氢键并与催化离子Mn2+配位的水分子，将质子转移给D257 的CO1 而自身形成OH-离子，此OH-离子夺取底物的质子使其带负电荷，其质子转移是由水分子/氢氧根离子完成的1。

GI在HFCS制备中的应用HFCS的工业化生产中的α－淀粉酶、β－糖苷酶价格相对较便宜，而GI生产成本较高，是生产HFCS最关键的一步，直接影响HFCS的产量和生产成本，因此GI的生产成本对HFCS的生产具有重要意义。目前报道的商业化产生菌的酶产量在1000～35000UL-1，因此，筛选更优良的GI、改善GI的催化性能和工艺条件以提高转化率和产量是生产HFCS的重要发展趋势4。如耐高温GI、 耐酸性GI、对底物亲和力提高的GI、对金属离子依赖性改变的GI、对抑制剂不敏感的GI。

GI的固定化为了增加GI应用于催化反应的批次，降低HFCS的生产成本，工业上一般采用固定化游离GI或产GI的微生物细胞的方法进行HFCS的生产。国外在GI固定化方面的研究较早，技术较成熟。20世纪70年代，通过交联、吸附和包埋等固定化技术实现了6种GI的固定化，并商业化出售。如杰能科公司生产的IGI是通过聚乙烯亚胺/戊二醛交联GI产生菌的细胞，并添加无机载体膨润土、硅藻土混合制得，固定化后的GI稳定性极好，在60℃的填充床反应器中的半衰期达到一年以上4。

国内有关GI固定化的研究也较多，但稳定性和酶活力方面仍低于国外水平。邓辉等5采用壳聚糖絮凝和戊二醛交联的方法，对表达生产褐色嗜热裂孢菌GI的重组大肠杆菌进行固定化，使固定化的酶活力达到356U·
g-1，半衰期达到61天，基本满足HFCS的工业生产要求。