[科普中国]-冷冻电镜技术让物质世界更清晰

北京时间10月4日17时45分许，瑞典皇家科学院在斯德哥尔摩宣布将2017年度诺贝尔化学学奖授予瑞士科学家Jacques Dubochet，美国科学家Joachim Frank，英国科学家Richard Henderson，以表彰他们发展了冷冻电子显微镜技术，用于溶液中生物大分子的高分辨结构测定。

作为诺奖家族中“最不务正业”的奖项，今年的诺贝尔化学奖得主却不是化学家，而是颁给了三位物理学家，他们的杰出工作帮助生物学家实现了结构生物学领域的新突破。

那么本届诺贝尔化学奖的主角——冷冻电子显微镜技术究竟有何过人之处？这三位科学家又做出了怎样突出的贡献而获此殊荣呢？

生物大分子的结构如同生命科学里的数学公式和物理定律，甚至在以后会充当生命科学里面的“化学元素周期表”，它是我们深入理解生命现象的微观结构基础，对生物医学、药物研发等一系列领域都具有重要意义。

早期的结构生物学研究中，X射线晶体学方法是解析生物大分子结构的主要方法，它与之后发展起来的核磁共振和冷冻电镜技术一起，构成了获得高分辨生物大分子结构的基础。

而近年来，**冷冻电镜在研究生物大分子结构，尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展。**该技术它可以快速、简易、高效、高分辨率解析高度复杂的超大生物分子结构，解决了许多其他方法不能得到的高分辨结构。其解析结果的分辨率不断刷新世界纪录，结构解析效率也迅速提高。很多科学家苦苦钻研了十几年甚至几十年的复杂结构很快被解析出来。

冷冻电镜技术通过快速冷冻，使蛋白质和所在的水溶液环境迅速从溶液态转变为玻璃态，玻璃态能使蛋白质结构保持其天然结构状态。如果以缓慢温和的方式冷冻，这个过程会形成晶体冰，生物分子的结构将被晶格力彻底损坏。低剂量冷冻成像能够保存样品的高分辨率结构信息，确保了从电镜图形中解析蛋白质结构的可能性。

Jacques Dubochet领导的小组在开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术方面做出了开创性的工作，因此获得了今年的诺贝尔化学奖。

在冷冻电镜技术出现之前，许多结构生物学科学家为了通过X射线晶体学得到蛋白质结构需要耗费无数的精力和漫长的时间，一个课题少则5到10年，多则20年。其原因在于制备出可以用于测定蛋白质单晶非常困难。

比如，核糖体从上世纪80年代初首次长出晶体到2000年左右最终拿到原子分辨率结构整整经历了20年。而冷冻电镜方法跳过超大分子复合物结晶难的这层技术屏障，以直接解析复合物的溶液状态的结构为目标，现在利用这项技术，科学家只需要很短的时间就可以解析一个新的核糖体结构，足见此项技术对于生命科学研究的革命性意义。

虽然冷冻电镜可以直接分析溶液状态的目标结构，但依靠低温冷冻电镜图像来推断生物大分子的结构依然是一大挑战。主要的问题就是，冷冻电镜的图像噪音极高、信号极低，若要从中提取近原子分辨率的结构信息，这就像在一个机器轰鸣的工厂里监测一只蚂蚁爬行的声音。

要解决这个问题，最有效的方法就是“重复(iterative)”，通过多次实验结果的叠加来提高信噪比。目前，主流的单颗粒三维重构技术通过对大量离散分布的单个分子的电子显微像进行统计分析来解析结构。不同的取向生物大分子颗粒在电子显微镜下得到不同的二维投影，再通过三维重构软件把获得的二维图像数据转化为三维结构模型。

这种方法最早由今年诺贝尔化学奖得主之一的Joachim Frank领导的课题组开发，从70年代开始，到90年代形成了比较完整的结构解析算法原理。而另一位诺贝尔化学奖得主Richard Henderson 则开创了二维电子晶体学三维重构技术，为之后的Joachim Frank等人的工作奠定了基本理论。

不同的取向生物大分子颗粒在电子显微镜下得到不同的二维投影

在过去的三十年，低温冷冻电镜设备取得了长足的进展，在样品制备、成像、计算机处理等实验技术方面有了一定的提升，这些使低温冷冻电镜成像技术的分辨率有了极大的提高。**其中一个关键性技术是引入了直接检测设备(direct detector device, DDD)照相机。**这种DDD设备能够直接在传感器上记录图像，从而绕过了传统的、需要闪烁设备和光纤的电荷耦合装置(charge-coupled device, CCD)探测器，以及其他一些在用摄影胶片(photographic film)记录图像时必须要经过的繁杂的处理过程。因此，**图像的信噪比也得到了极大的提升。**这就好比说现在的电镜是一台摄像机，可以拍摄一段录影，记录整个过程，而不再像以前那样，只是一台照相机，只能够拍摄出一张张固定的图像。

有了大量高质量的图像，再借助三维重构软件，科学家们就可以获得高质量的生物大分子的三维结构，例如下图中分辨率高达3.2埃米（1Å=0.1nm）的线粒体核糖体亚单位图像。

2013年底，美国加州大学旧金山分校的程亦凡与David Julies研究小组在Nature上合作发表了两篇论文，首次通过冷冻电镜获得了原子级分辨率的膜蛋白结构，这是冷冻电镜发展史上里程碑式的进展。

此后，冷冻电镜技术吸引了更多结构生物学家的关注，越来越多的人投入到冷冻电镜的研究当中，今年使用冷冻电镜技术解析的蛋白质结构飞速增长，已经成为结构生物学中最重要的方法。

构成酵母线粒体大核糖体亚单位（yeast mitochondrial large ribosomal subunit）的各个组成蛋白质

未来，冷冻电镜技术的发展将日臻成熟，新的硬件设备、软件算法会不断被开发出来，帮助生物学家看到更多以前无法想象的结构信息。在新技术的帮助下，细胞中复杂而精妙的各种生化反应过程将会被揭示，人们能直接看到那些分子机器是如何操作原子和分子，从而更加深入地思考生命现象的本质。