[科普中国]-金属硫蛋白

发现

1957年，美国科学家Margoshoes在研究金属生物学作用时，从动物器官中分离出镉的金属蛋白质。由于它是一种低分子量、高巯基含量,能大量结合重金属离子，因此称为金属硫蛋白（简称MT）。MT分子呈椭圆形，分两个结构域,分子量为6,000～7,000道尔顿,直径30～50 A,含有61个氨基酸,其中20个氨基酸为半胱氨酸，少数有21个,这样每一个MT分子就可以结合7～12个金属离子。人体、动物、植物以及微生物体内均含有MT，而且其理化特性基本一致，具有特殊的光吸收。MT构象较坚固,具有较强的耐热性。

MT****的用途

MT 的重要生理功能表现在它是一种目前所知的最有效的自由基清除剂，其清除自由基（·OH）的能力约为SOD的几千倍，而清除氧自由基（·O）的能力约是谷胱甘肽（GSH）的25 倍，而且具有很强的抗氧化活动。

由于 MT 具有特殊的化学结构，其中的金属具有动力学不稳定性，巯基具有亲核性倾向，使得MT 易与某些亲电性物质，特别是与某些自由基相互作用。2

研究对于金属硫蛋白的研究,国内外主要集中在提取、检测以及应用上。由于在实际生产中,主要采用层析法,分离纯化后的金属硫蛋白中还含有其它的杂蛋白,因此本文作者正在进行金属硫蛋白的分子印迹聚合物的研究,使其更好地应用于金属硫蛋白的纯化。

理化性质MT构象较坚固,具有较强的耐热性,生物学性质稳定,同时抗酶解,而且蛋白质氮基酸排列有重复性,在氨基酸链断掉一部分后仍会有活性。3MT所有的半胱氨酸以还原状态出现。

一般来说，哺乳动物的MT分子量为6000～7000道尔顿，但去金属后即硫蛋白分子量为6000道尔顿左右，而真核微生物的MT分子量范围较大，为2000～10000道尔顿，如从粗糙脉孢菌中分离出来的MT分子量为2500道尔顿左右，酵母菌中分离得到的MT分子量为8000～10000道尔顿。高等植物的MT的分子量为10000～13800道尔顿。MT的等电点pI一般在4左右，如哺乳动物MT的等电点在3.9～4.6之间，已发现的水生生物MT的等电点在3.5～6.0之间。使各种金属硫蛋白中50%的金属离子发生解离的pH分别为Zn-MT 3.5～4.5,Cd-MT 2.5～3.5，Cu-MT pH﹤1.0，但对植物中的MT来说，相应的pH要偏高些。MT的存在形式及稳定性与它所结合金属的种类，是否结合了金属及环境的pH密切相关。同样，MT的光吸收特征除了与它的氨基酸组成有关外，也与它所结合的金属种类密切相关。

分类分布MT的结构在生物进化中高度保守，有四种异构体，MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在，尤以肝、肾细胞为主，而且参加其功能调节。MT-Ⅲ分布主要限于中枢神经系统，主要分布于星性胶质细胞（集中于细胞体和突起中），其次为神经元细胞，也有报道称少量分布于生殖细胞、小肠、胃、肾和嗅觉皮质细胞中。MT-Ⅳ主要分布于皮肤、舌、消化道等器官的角质细胞和复层鳞状上皮细胞中。

提取方法主要试剂：

三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）；5，5-二硫二（2-硝基苯甲酸）（简称DTNB）；PBS缓冲溶液。

动物的处理：

参考Onsaka等的方法，给家兔皮下注射ZnSO44次，第1天注射60mg/只（约15mg Zn/kg），第2、4天注射90mg/只，第7天注射120mg/只，第8天处死动物取其内脏。

MT粗制品的制备：

1）称重：将前一夜放-4℃冰箱中解冻的试样拿出来用托盘天平称重，试样重量M，精确到0.1g；

2）搅碎：将试样用剪刀剪成碎片后，用捣碎机捣约30～50s，捣成匀浆；

3）提取：加入相当于试样重量两倍体积的0.02MTris-HCl，用磁力搅拌器搅约半分钟；

4）变性：加入等体积氯仿：乙醇（0.08：1）变性除杂蛋白，搅拌约5分钟；

5）离心：5000rmp、4℃离心25min，弃沉淀，取上清；

6）热变性：75℃热变性3～5min除杂蛋白；

7）过滤：用冰块速冷后用8层纱布过滤，取清液，静置约2h；

8）离心：8000rmp、4℃离心25min，弃沉淀，取上清，得到匀浆液。

9）层析、冻干：对匀浆液进行层析，然后收集富含MT的层析液进行冻干即得MT粗品。

纯化方法所谓纯化，也就是MT粗品（60%～90%）、MT精品（≥90%）以及纯品（≥95%）的形成过程。由报道的资料看，纯化方法大概是一致的，首先是根据MT-1和MT-2所带电荷不同的性质，进行离子交换将MT-1和MT-2分开，然后将收集MT-1和MT-2的层析液分别进行脱盐，最后收集冻干、保存。

取匀浆液直接上Sephadex G-50柱（4.5×100cm）进行分离，以0.01mol/LTris-HCl，pH8.6缓冲液洗脱。收集含MT组分层析液，再上预先用0.01mol/L Tris-HCl，pH8.6缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow（3×70cm）柱进行离子交换层析，以Tris缓冲液进行直线梯度洗脱（A液：0.01mol/L Tris-HCl，pH8.6； B液：0.25mol/L Tris-HCl，pH8.6）。分别收集含MT-1和MT-2组分，冷冻干燥浓缩成体积15～20mL，再分别上预先用0.01mol/L碳酸铵平衡好的Sephadex G-25柱（1.6×120cm）进行脱盐。所得MT-1和MT-2冷冻干燥后保存于-20℃冰箱中。

虽然文献中讲到许多分离纯化方法，但是多为实验室研究，真正运用到实际生产的并不多，这主要与实际生产中的各种环境因素的影响有关。在实验中发现，诱导后家兔肝脏中MT的含量愈高，实际生产中MT的提取率就愈大，相反，MT的提取率就愈低。

检测方法随着对MT研究的进一步深入，建立的MT检测方法较多，但所有这些方法都是建立在MT的理化特性和生物特性以及免疫学特性基础上，主要分以下几大类。

金属亲和分析法这类方法主要是基于MT对金属的高亲合力且不同金属的亲和力具有差异性及其热稳定性而建立的。主要通过测定MT结合金属—竞争性替换金属含量来检测MT中金属含量的增高，从而计算出MT的含量。张保林等运用银饱和分析法结合原子吸收光谱（AAS）检测了兔肝Zn-MT，具体方法为：向含MT的溶液中加入过量的Ag+，待反应完全后，再逐次加入血红蛋白，以结合剩余的Ag+，加热使血红蛋白沉淀，与MT结合的Ag+则完全存在于上清液中，通过AAS测定其中Ag+含量，便可计算出MT的浓度，该方法与其它方法比较，不需要去除样品中共存的其它蛋白质和含-SH基剂，可直接计算出MT含量，且不需要特殊的仪器设备，操作简便，具有很高的重复性和准确性。金属亲合分析的缺陷在于，采用的金属除与MT结合外，还与其它一些小分子量化合物结合，由于利用金属含量间接推算MT含量，因此特异性较差。

电化学法此方法主要是利用巯基（-SH）在汞滴表面产生氧化还原出现的电位变化建立的，以测定巯基来计算MT的含量，是一种可以直接用于测定MT总量的方法，具有一定的特异性。其检测限可达ng/ml水平。

运用检测MT的电化学方法有：示差脉冲极谱法（DPP）、微分脉冲极谱法、示差脉冲阳极溶出伏安法（DPASV）和循环伏安法（CV）等。Bordin等通过改变检测体系的pH值，利用DPP可以很方便地检测出样品中多种形式的MT，同时能快捷地分析出还原型的MT。

色谱分析法对MT中不同亚型的检测，色谱分析法较为适合，应用的色谱分析法主要有HPLC、RP-HPLC、HPLC-ICP-MS、HPLC-AAS等，利用这类分析方法可以对Zn-MT的性质进行检测分析，但此类方法需要有标准的MT样品进行对照。Hunziker等使用RP-HPLC从兔组织样品中可以分离出7种亚型，通过AAS来检测样品中的金属含量，可以对MT进行定量测定。Jin等利用HPLC分离MT，然后根据样品对250nm紫外吸收特征来直接对MT定量，该方法的灵敏度小于1μg/mL。由于常见的两种MT所带的电荷不同，与其它方法相比，利用毛细管电泳法可以更好地分离纯化MT-Ⅰ和MT-Ⅱ。

蛋白质分析法/免疫法此类方法主要是通过蛋白质含量测定来计算MT浓度，免疫法是最主要的方法。它尤其适合于微量检测，具有灵敏、特异的特点，灵敏度在pg/ml级，对存在体液中含量甚微的MT具有较好的检测效果。在近些年，先后建立了Western Blotting法、放射性免疫检测法（RIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）。

RIA法首先由Mallie等在1979年检测大鼠血清中MT的含量时建立的，随后Mulder等建立了测定人体液中MT含量的RIA，Zahir Shaidh A等报道了用RIA检测镉污染地区人群的尿液MT含量。此方法的检测范围在0.1～100ng/ml之间，但是此方法要用放射性同位素，需要3天左右的时间，给检测带来不便。

1986年Thomas等建立了ELISA法，与RIA法无显著差异，灵敏度可达100pg/ml，与RIA相比具有测定相对迅速，且不需昂贵的仪器设备和接触放射性同位素。Akintola等在1995年利用MT-1制备抗体建立了ELISA测定人血浆和尿液中的MT含量，检测限可达5ng/ml。郑军恒等在检测人血液中的MT过程中建立了2种ELISA方法，直接型ELISA的检测范围为1～10ng，可用于检测较纯样品，竞争性ELISA较好的检测范围是50～500ng，用于检测较粗的样品中MT的含量。

光谱法采用液相色谱（LC）和紫外（UV）相结合检测确定家兔肝脏中分离脱金属硫蛋白的最佳条件，同时，利用LC-ES-MS可以确定家兔肝脏中不同结构的脱金属硫蛋白，主要对MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的结构及其同分异构体进行了研究。

由于目前金属硫蛋白的测定主要采用紫外-可见分光光度法以及原子吸收光谱法测定其中的金属离子。前一种方法灵敏度较低，由于检测取样少，检测过程中造成的误差较大，后一种方法却因为分离纯化过程中可能有部分金属脱离蛋白造成损失引起误差，且测定费用昂贵。针对这种情况，建立了镉金属硫蛋白的非原子化测定方法，检出限与石墨炉法（GFAAS）相近。

克隆及检测随着分子生物学技术的快速发展，使MT克隆技术、RNA印迹技术和PCR技术应用于MT的定量检测成为现实。MT克隆检测是通过MT多克隆和单克隆抗体，运用免疫扩散、免疫电泳等方法来检测组织中的MT-mRNA含量进行定量分析，这在MT分子的生物学研究中有很重要的意义。

MT多采用联机检测，虽然以免疫法最为可靠，但是检测过程复杂，时间消耗大，联机检测大大节省了时间，同时可以减少检测过程中产生的误差。MT在逐步产业化，然而目前还缺乏一种简便、灵敏、快捷适宜产业化的分离纯化和检测技术，这也成为MT研究的热点。

有关功能重金属解毒功能MT是富含半胱氨酸的金属结合蛋白，其巯基能强烈螯合有毒金属，并将之排出体外，从而实现解毒功能。4MT与痕量金属的代谢有关，在所有的哺乳动物组织中，MT-1和MT-2协同表达。MT-3是该家族中的脑部特异成员，能结合锌和铜，具有重要的神经生理和神经调节功能。对许多水生生物的研究表明，MT在基本金属元素的调节中起重要作用，并且对非基本的金属元素有抑制和解毒作用。MT通过与重金属结合可以有效的减轻重金属对机体的毒害，是目前临床上最理想的生物螯合解毒剂。

环保作用利用MT与金属结合的特性，可以选育或用基因工程手段建立MT的高表达系统，以治理重金属污染。据报道，转酵母MT基因的烟草能显著提高对污染土壤中cu2的吸收，用这种方法可以对重金属污染区进行补救。

MT与抗辐射电离辐射可以产生大量自由基，直接或间接使生物体受到损伤。据研究表明，口服MT能够延长被一次性大剂量电离辐射的小鼠的存活时间，降低一次性大剂量和多次小剂量电离辐射对免疫系统的损伤，口服MT能吸收进入体内的大量Cys，为修复体内受辐射作用而断裂的二硫键提供原料。

MT与Parkison(PD)病许多实验证明，MT对神经系统有保护作用。实验显示，在转基因小鼠中，MT-1的过表达可以改变脑炎症状，促进脑修复，是神经细胞中的保护因子。通过鼠刺伤模型和缺血模型的研究发现，MT一3参与中枢神经系统损伤修复。PD病是由于6一羟基多巴胺诱导自由基而产生的，而脑中某些MT异构体的诱导剂，如氧化压力、细胞因子和炎症过程等能防止这种神经毒害，这与MT清除自由基有关。

其他作用MT清除自由基的功能使其在抗衰老、抗氧化压力及细胞凋亡等过程中发挥着重要作用。MT是一种潜在的细胞凋亡负调控因子，并且在化疗中对正常机体细胞有一定的保护作用。

心血管病MT作为一种强的内源性细胞保护剂，在心血管系统抗损伤保护中发挥着重要作用，主要表现在对缺血再灌注损伤的抑制作用。临床实践证明，缺血预处理能提高体内MT含量，从而减轻再灌注造成的损伤。据实验证明，MT参与预缺血的心肌细胞保护，并通过保护氧化酶活力减轻心肌细胞缺氧/复氧所导致的损伤。

与肿瘤MT参与肿瘤细胞的分化和增生。MT与肿瘤的关系的研究主要集中在MT与肿瘤发生、减轻抗肿瘤药物毒副作用以及与肿瘤细胞获得性耐药性等方面．MT表达缺陷是肿瘤发生的症状之一，因此，深入研究MT与肿瘤的关系，可望获得治疗肿瘤的靶药物。

安全性1、LD50﹥10g/kg

2、致突变实验（Ames试验，微核及精子畸形试验）阴性。

3、亚慢性毒性试验：阴性

用途金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸和金属的低分子蛋白质。由于它大量的结合多种金属离子，具有特种的生理功能，为生物化学领域所重视。

MT的研究已有 40多年的历史, 对其结构、特性、基因调控及生物学功能的研究日趋深入，研究成果已涉及医学、毒理学、营养学、生物工程、美容护肤等各个领域，应用前景十分广阔。5

市场状况根据MT在化妆品、保健品和新医药等三个领域的应用发展情况，结合我国消费者的实际水平，以及新医药发展的步骤和速度，化妆品行业年需求20千克左右，婴幼儿食品添加年需求10㎏左右，中老年保健食品年需求10-20千克，新医药年需求20千克左右，而产量为：2003年为6.8千克，2004年为8.6千克，2005年为9.5千克，远远不能满足实际需求。2005年国内市场价：化妆品、保健品用300万元/千克，医药用800-1000万元/千克。2005年国外最新报价为8250万美元/千克（商品号M7641）。

目前国内采用的都是用兔肝生产金属硫蛋白，设备投入大，转让费高，而且产量低，中国科学院专家经过几年的努力研制出用猪肝生产金属硫蛋白技术，项目技术成果整体上居同类研究的国际先进水平，已获国家发明专利，并通过鉴定，获得国家自然科学基金的资助。