[科普中国]-酶化学修饰

简介

通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性，这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术，称为酶分子的化学修饰。自然界本身就存在着酶分子改造修饰过程，如酶源激活、可逆共价调节等，这是自然界赋予酶分子的特异功能，提高酶活力的措施。从广义上说，凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的转变都可看做是酶的化学修饰，从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。

酶化学修饰的目的在于人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。通常，酶经过改造后，会产生各种各样的变化，概括起来有：①提高生物活性，包括某些在修饰后对效应物反应性能的改变；②增强在不良环境（非生理条件）中的稳定性；③针对异体反应，降低生物识别能力。可以说酶化学修饰在理论上为生物大分子结构与功能关系的研究提供了实验依据和证明，是改善酶学性质和提高其应用价值的一种非常有效的措施。1

方法1、定点突变

目前，科研人员已开始通过一些可控制的方法在酶或蛋白质特殊的位点引入特定分子进行修饰，并结合定点突变引入一种非天然氨基酸侧链来进行化学修饰，从而得到一些新颖的酶制剂。这一策略是利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化合物，得到一种化学修饰突变酶（Chemically modified mutant enzymeCMM）。已利用定点突变法在枯草杆菌蛋白酶SBL的特定位点中引入半胱氨酸，然后用甲基磺酰硫醇试剂进行硫代烷基化，得到一系列新型的化学修饰突变枯草杆菌蛋白酶。酶的kcat/KM值随疏水基团R的增大而增大，而且绝大部分CMM的kcat/KM值都大于天然酶，有些甚至增加了2.2倍，因此CMM能够改进酶的专一性及扩大催化底物范围。

2、交联技术

使用双功能基团试剂如戊二醛、PEG等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分，进行共价交联，可使分子活性结构加固，并可提高其稳定性，扩大了酶在非水溶剂中的使用范围。已使用戊二醛进行酶交联的研究，证实了利用交联酶晶体（crosslinkedenzyme cry stal，CLEC）技术提高了嗜热菌蛋白酶的生物活性，增加了其热稳定性。枯草杆菌蛋白酶经预处理，冻干形成交联酶晶体，在有机溶剂和水溶液中的稳定性大大增加，活力可提高13倍。交联酶晶体制备分为两步：①酶晶体的形成；②保持酶活性，保持酶晶体的晶格不被破坏，进行化学交联。多功能交联试剂除了传统的戊二醛外，还包括一些新近开发成功的化合物，例如，糖基化作用与交联技术联合应用于青霉素G酰化酶，利用葡聚糖二乙醛将青霉素G酰化酶进行交联，使其在55℃下的半衰期提高9倍。酶的稳定性提高的主要原因是交联增强了葡聚糖的羟基与酶分子亲水基团间的相互作用。

3、小分子化合物

利用小分子化合物对酶活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，可以改变酶学性质。已被广泛应用的小分子化合物主要有邻苯二酸酐、氨基葡萄糖、醋酸酐、硬脂酸等。D-葡糖胺与未糖基化的RNase A进行化学偶联，得到单糖基化酶和双糖基化酶，其中，53位的天冬氨酸和49位的谷氨酸被认为可能是糖基化位点，经过修饰的单糖基化RNase A活力比天然酶低，但是热稳定性大大提高。氧化还原酶中的谷胱甘肽过氧化物酶是不稳定的，但人们对它很感兴趣。通过使用化学修饰的方法，用不稳定的氧化型硒原子取代胰蛋白酶中195位丝氨酸γ位的氯原子，使之转变为硒基胰蛋白酶，硒基胰蛋白酶失去了还原酶的活性，而表现出较强的谷胱甘肽氧化酶的活性。

4、单功能聚合物

单功能试剂的化学修饰可以使酶结合成具有特异功能的单位或聚合体。两性分子聚乙二醇PEG及其衍生物PM是最常用的化学修饰剂。它不仅能提高酶在有机溶剂中的稳定性和溶解性，而且也能降低一些治疗用多肽类药物的抗原性。例如，念珠菌属脂肪酶CRL用对硝基苯基氯仿和氰尿酸氯化物活化的PEG处理后，在异辛烷中的稳定性大大提高，活力也提高许多。酶的PEG修饰包括两个步骤：①PEG的活化；②活化后PEG与酶的共价结合。目前，已有一些酶采用PEG法进行修饰，如细胞色素C、内-β-葡萄糖酶、胰蛋白酶等。细胞色素C经PEG修饰，其羟基被酯化，得到性质改进的生物催化剂，其在同样条件下，能够氧化更多的芳香族化合物，因此，化学修饰被认为是创造新型生物催化剂的一种有效方法。辣根过氧化物酶用mPEG共价修饰，在极端PH条件下抗变性能力提高，耐热性也有所增加。2

应用1、酶结构与功能的研究

化学修饰在研究酶的结构与功能方面的应用最多，研究也比较细，是最简便的一种方法。特别是蛋白质的可逆化学修饰，在这方面能提供大量的信息。修饰蛋白质的氨基的过程中，可以向蛋白质引入正电荷或负电荷。通过蛋白质带电荷的羧基同水溶液碳二亚胺反应，也可以向蛋白质引入一个正电荷，这样就改变了蛋白质的表面电荷，由此而产生的静电效应常引起分子膨胀，这有利于蛋白质和水的相互作用，甚至可造成蛋白质分子之间的接触点断裂。因此，不需要加入脲或胍，一些寡聚体蛋白质即选择性地被解离成可溶性亚基，它们在水中很少发生聚集，并保持其生物活性，从而有利于这些蛋白质分子量的精确测定。另外，化学修饰也常用于氨基酸顺序分析中。由于胰酶对精氨酸和赖氨酸具有高度特异性，故常用此酶水解蛋白质，以制备肽碎片。为防止精氨酸和赖氨酸相互干扰的问题，可利用选择性化学修饰剂修饰赖氨酸和精氨酸，使水解局限在其中一个残基的肽键上。

2、在医药方面的应用

随着科学技术的进步，人们发现许多疾病与酶有密切关系。酶在疾病的诊断、治疗等方面发挥着越来越重要的作用。但是，由于各种原因使酶的作用受到了限制。例如，天冬酰胺酶是治疗白血病的有效药物，但它往往带有抗原性，若不除去，再度使用可能引起免疫休克。因此，有人用聚乙二醇修饰此酶的两个氨基，消除了抗原性。已利用高碘酸氧化法活化的右旋糖苷对大肠杆菌L-天门冬酰胺酶Ⅱ进行化学修饰，使酶抗胰蛋白酶水解的能力明显提高，抗原性显著减弱。将牛血铜锌-超氧化物歧化酶（Cu，Zn-SOD）用β-环糊精修饰后，抗炎活性增强，抗原性降低，稳定性提高。

3、在工业方面的应用

目前，生物催化技术在工业上得到广泛应用，大大提高了产量，降低成本，而且减少了对环境的污染。但工业生产要求高温、高压等条件，天然酶极易失活，而经过修饰的酶则完全克服了这些缺点。2