[科普中国]-酶联免疫标记技术

简介

酶联免疫标记技术是继荧光标记技术、放射性核素标记技术之后发展起来的一项灵敏、特异、快速且可实现自动化的新技术，由于具有安全、稳定、容易观察等优点，近几年来发展十分迅速。此实验是根据抗原或抗体结合到固相载体表面后，能保持其免疫活性，而抗原或抗体与酶结合后也能保持免疫学和酶的活性。酶结合物与相应抗原或抗体形成复合物，在底物的催化下发生显色反应，可根据加入酶底物溶液的显色深浅反应，判定有无相应的免疫反应及抗原或抗体的量。

自20 世纪70年代问世以来，就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点，成为检验中广泛应用的方法之一， 其中应用最多的是酶联免疫吸附法(ELISA) 。由于ELISA 的技术条件要求低，携带方便，操作简便和经济，常以试剂盒的形式出现且易商品化，它已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术。

ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，根据酶反应底物显色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接放大了免疫反应的结果，使测定具有极高的灵敏度，在应用中一般采用商品化的试剂盒进行测定。完整的ELISA 试剂盒包含7个组分，分别是：包被了抗原或抗体的固相载体、酶标记的抗原或抗体、酶的底物、阴性和阳性对照品、参考标准品和控制血清、结合物及标本的稀释液、洗涤液、酶反应终止液。

ELISA 在食品安全检测中的应用近年来，ELISA 技术在食品安全检测中正逐步得以推广应用，如对天然毒素、农药残留、兽药残留、致病微生物、转基因成分和激素等的检测1。

毒素检测真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物,其中的十几种对人危害较大, 它们一般都具有毒性强和污染高的特点, 而毒性最大、致癌性最强的是黄曲霉毒素(AFL) 。自1977 年黄曲霉毒素B1的单克隆抗体问世至今,几乎所有重要的真菌毒素( 如赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉毒素、伏马毒素等) 的ELISA 检测方法均已建立。在对黄曲霉素B1 的检测中, 其检测的线性范围为0.25～5.0 ng/mL, 灵敏度为12.5 pg, 整个检测过程为4 h。

农药残留检测应用ELISA 检测食品中的残留农药主要为除草剂、杀虫剂和杀菌剂。1993 年, 王勇等建立了测定三唑酮的ELISA 方法, 应用于黄瓜、梨等食品的检测,其最低检出限为40 ng/g, 回收率为92.44% ～98.18% , 与用气相色谱检测的结果吻合。1995 年, 余万俊等用抗杀虫脒单克隆抗体为试剂, 建立了间接竞争法、直接竞争法和标记抗原竞争法3 种检测大米中杀虫脒的ELISA, 使用直接竞争法的检出限为0.05 ng/g, 相对标准偏差为5.1% ～16% 。2000 年Watanabe E 等用合成的烯菌灵半抗原偶联蛋白质形成大分子免疫原进行免疫生产单克隆抗体, 建立了测定柑橘类水果中烯菌灵的ELISA 法。对日本柠檬、柑橘和葡萄柚中烯菌灵的检测限为5 μg/g。2000 年Katsoudas E等建立了新鲜食品中氨基甲酸酯类杀虫剂残留的ELISA 法。在香蕉、番茄、桃等果蔬中检测胺甲萘以及虫螨威的检测限分别为2.0 μg/g 和8.0 μg/g。尽管ELISA 的检测限度还不能完全达到经济发达国家技术法规和限量标准的要求,而且存在抗体制备不易和不能同时完成多种农药残留检测等缺点, 但是由于该技术具有样品前处理简单、分析时间短、适合做成试剂盒用于现场筛选等优点, 使其可在蔬菜产区、蔬菜批发市场配备, 随时把农药残留超标的蔬菜、水果杜绝在食用之前, 因此特别适用于我国分散生产、分散销售的现状。

兽药残留检测目前大部分ELISA 主要用于动物组织及其代谢物中兽药残留及饲料中违禁药物的测定, 其检测限和灵敏度都达到相当高的程度。其中检测磺胺类、氯霉素类、苯并咪唑类、同化激素类、苯乙胺(β- 受体激动剂) 类药物一般采用抗体包被直接竞争法。该法主要用于饲料、牛奶、血浆、猪肝脏、牛肝脏和猪尿中上述药物的测定。如对国家严禁使用的盐酸克伦特罗( 瘦肉精) 的测定, 血清中最低检测浓度为0.5 ng/mL, 动物组织中最低检测浓度为0.5 μg/kg, 饲料中最低检测浓度为5 μg/kg。另外, 沈美芳等用ELISA 法检测水产品中氯霉素残留, 氯霉素浓度在0.05～4.05 μg/kg, 最低检测限为90 ng/kg。结果表明该方法灵敏度高、重复性好, 适合水产品中氯霉素残留筛选检测。检测氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类药物一般采用抗原包被直接竞争法, 该法主要用于牛奶、血浆、尿液及肾脏组织中卡那霉素、庆大霉素、新霉素等药物的测定, 最低检测浓度达0.3 ng/mL。检测β- 内酰胺类、喹诺酮类、阿维菌素类、聚醚类和多肽类药物一般采用抗原包被间接竞争法, 该法主要用于饲料、鸡肝脏、鸡肉、牛奶、血清、牛肝脏中杆菌肽锌、盐霉素、莫能菌素、伊维菌素及青霉素的测定。如鸡肝脏组织中盐霉素的最低检测浓度为1～10 ng/mL, 饲料中杆菌肽锌的最低检测浓度为1.0 mg/kg, 血清、牛乳中恩诺沙星的最低检测浓度为1～10ng/mL。

细菌污染检测ELISA 法可检测沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌等病原微生物, 其中沙门氏菌是最常见的致病菌。用ELISA 试剂盒较传统检测法更能方便、快速地检测沙门氏菌。用ELISA 法检测沙门氏菌采用的抗体既可以是单克隆抗体(McAb) , 也可以是多克隆抗体。另外, Lyer MS 和CousinMA 等人研究用间接ELISA 法来检测食品和饲料中镰刀菌的灵敏度和特异性, 可检测出102～103 cuf/mL 的含量。

转基因食品检测目前对转基因食品检测主要采用两种方法: (1) PCR 法用于直接检测转基因; ( 2) ELISA法用于间接检测转基因表达的目的蛋白质。美国FDA 已研究出用双夹心ELISA 法检测食品中是否含有转基因玉米成分。EnviroLogix ELISA 试剂盒可用于测定玉米中的Cry9C蛋白, 在同一实验室和实验室间共测定了9 种含玉米的食品, 测定结果的重现性很好。Lipp 等使用ELISA 法, 通过抗体特异性地与CP4- EPSPS ( 5- 烯醇丙酮酰莽草酸- 3-磷酸合酶, 来源于农杆菌CP4) 蛋白结合, 检测RRS( Rundup Ready Soybean, 抗草甘膦大豆) 。13 个EU 成员国和瑞典共37 个实验室研究结果表明, 大豆干粉中转基因组织(GMO) 含量为2%, 检测可信度达99%。

影响ELISA 的因素ELISA 是利用抗体的选择性和标记酶的化学放大灵敏性而建立起来的, 因此, 影响ELISA 测定结果的因素主要包括:

1. 抗原包被: 包被的质量是影响抗原- 抗体反应的重要因素。目前蛋白质类抗原的包被技术已经相当成熟, 但是对半抗原, 通常采用以半抗原- 载体结合物的形式包被。蛋白质( 如牛血清白蛋白、卵白蛋白) 是最常见的载体,但存在重现性不好、易和抗体发生交叉反应的缺陷。Verschoor 报道用尼龙作为半抗原载体, 效果会更好。

2. 非特异性反应: ELISA 中可以发生许多非特异性反应, 严重干扰分析结果, 选择适当抗体组合可以明显地减少这类反应的发生。通常采用一些简单的前处理, 如在包被液中加入牛血清白蛋白或明胶等封闭剂, 在洗涤液中加入Tween 20 等。高选择性的单克隆抗体代替多克隆抗体也是提高ELISA 特异性的另一个有效途径。

3. 酶和抗体的偶联: 酶和抗体偶联的好坏直接影响试剂的灵敏度。应用于ELISA 的酶主要有辣根过氧化氢酶(HRP) 和碱性磷酸酯酶(AKP) , 其中以HRP 用得最多。目前HRP 与抗体的偶联多采用改良的高碘酸钠氧化法( 改良Wilson's 法) , AKP 与抗体偶联通常采用戊二醛法和偶氮法。

4. 酶的底物: 当酶标记抗体- 抗原复合物和酶的底物相遇时, 复合物中的酶水解底物, 使无色的底物溶液生成有色的反应产物, 根据颜色的深浅测出待测物。因此酶底物的选择对准确和迅速地显示结果影响很大。HRP 如果采用H2O2- 邻苯二胺或H2O2- 邻联甲苯胺作为底物, 由于反应产生的颜色深浅与H2O2 的用量有关, 因此在底物溶液的配制时应注意控制好H2O2 的用量。但目前更多的采用3', 5'- 四甲基联苯胺( TMB) , 因为其毒性小又稳定。

5. 洗涤: ELISA 法中每次反应后都要洗涤, 这既保证了反应的定量关系, 也除去了血清中与反应无关的其他成分及游离的酶复合物。洗涤效果与检测结果密切相关, 因此, 最好做到洗涤步骤按标准化操作2。

ELISA 技术的发展趋势基因工程和蛋白质工程的发展, 为生物酶标分析技术提供了新的技术思路和方法,弥补了其缺陷和技术局限, 使其具有更为广泛的检测范围、更高灵敏度与特异性和更精确的定量能力, 从而使ELISA技术以新的形式应用于食品检测领域。系列化、标准化、商品化和多功能化的新型ELISA 试剂盒产品不断被开发出来。该技术未来的发展将呈以下趋势1:

1. 高度免疫原性的重组抗原: 通过基因工程技术可以快速、批量生产出具有高度免疫原性的重组抗原, 用来替代某些无法从天然材料中分离的抗原物质, 进一步扩大了ELISA 检测范围。重组抗原在纯度上要高于通过裂解病原体所提取的抗原。用于检测的重组抗原有可能最终达到以下两个标准: ( 1) 包括所有能引起机体强免疫应答的病原体抗原决定簇; ( 2) 不含或尽可能少含非特异性抗原或共同抗原。

2. 多项目标物快速测定: 利用酶联免疫技术同时对待测样本中的多项目标物进行快速测定, 可节省测定时间。可通过以下两种方法来达到这一目的: ( 1) 通过基因工程技术表达特定的融合蛋白质将多种不同蛋白质的功能构建在一起, 可以快速方便地同时检测多项目标物; ( 2) 采用几种能够催化各自底物产生不同显色反应的酶分别标记具有不同特异性的抗体或抗原, 反应后用各自的酶底物显色, 从而达到同时检测多项目标物。

3. 天然酶定向改造和体外分子进化: 运用天然酶定向改造和体外分子进化手段, 研究开发的免疫测定标记酶融合蛋白( 一种同时具有催化底物显色反应酶活性和特异性抗体或抗原性质的融合蛋白) 可以作为结合物直接用于ELISA 试剂盒。这使得ELISA 试剂盒在其生产过程中不但避免了繁琐且低效率的酶与特异性抗体或抗原的化学交联过程, 而且无需得到纯化的酶和抗体或抗原, 从而大大提高了ELISA 试剂盒产品的稳定性, 使其结果具有更好的重现性。

4. 自动化的酶联免疫测定技术: 近几年出现的全自动酶标测定仪, 不但大大减轻了检测人员的工作强度, 而且也提高了测定的准确性和重现性, 这更有利于ELISA 技术在检测分析中的进一步商品化推广3。