[科普中国]-抑菌圈法

目前抑菌圈研究法中使用最多的主要有K-B法（Kirby-Bauer test）、牛津杯法和打孔法三种。K-B法即滤纸片法，选用质地均匀的滤纸，用打孔机打成直径相同的圆片，灭菌后烘干，浸泡于待测样品中，然后置于试验平板中培养一段时间后测定抑菌圈大小的一种方法。牛津杯法又称杯碟法，将已灭菌的牛津杯置于试验平板中，往杯中注入一定量的待测样品，培养一段时间后测定抑菌圈大小的一种方法。打孔法，是指用已灭菌的打孔器或钢管在试验平板上打孔，往孔中注入一定量的待测样品，培养一段时间后测定抑菌圈大小的一种方法。1

1、主要器皿及用品
培养皿（直径90 mm）、打孔器（孔径6 mm）、牛津杯（内径6 mm）、不锈钢圆管（外径6 mm）、滤纸、三角瓶（250 mL）。

2、培养基
液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10 g/L，pH 7.8。
平板培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10 g/L，琼脂粉20 g/L，pH 7.8。
3、 方法
菌种的活化及菌液的制备：将冷冻保存的菌种划线接种至平板培养基，37℃培养24 h；挑单菌落接种至100 mL液体培养基，37℃、200 r/min摇床培养过夜，菌液备用。
试验平板的制备：

涂布平板法：先往已灭菌的平板中倾注20 mL左右平板培养基，水平静置凝固，接种0.1 mL菌液，涂布均匀后备用。
倾注平板法：先往已灭菌的平板中接种1 mL菌液，然后倾注约20 mL已冷却至50 ℃左右的平板培养基，混合均匀，水平静置凝固后备用。
预加菌液倾注平板法：往已冷却至50 ℃左右的平板培养基中注入一定量的菌液，混合均匀，倾注平板（约20 mL/平板），水平静置凝固后备用。

目前流行的试验平板制备方法主要有3个：①涂布平板法、②倾注平板和③预加菌液倾注平板法。
方法①获得的试验平板其抑菌圈清晰，但菌体生长不够均匀，重复性较差，效果一般；方法②和方法③获得的试验平板其抑菌圈清晰，菌体生长均匀，重复性好，效果好。综合试验过程的各步骤细节，方法①导致菌体生长不均匀的原因可能是涂布操作不能很好地保证菌液平均分布于平板的各个角落，且重复性不够好；方法②和方法③的效果均较好，但方法③获得的试验平板质量会更高，原因是在制备平板前把菌液加进培养基中，摇均匀后再倾注平板，保证了每个平板中菌的浓度是一样的，这一点是方法②无法做到的，从而保证了试验的一致性。

当抑菌剂含量一定时，抑菌圈的大小跟菌体浓度有很大关系，如果菌体浓度过大，会拮抗抑菌剂的作用，导致抑菌圈偏小。因此，对试验平板中的菌体数进行梯度浓度试验，可确定实验最适合的活菌浓度。

对比抑菌圈的K-B法、牛津杯法和打孔法，结果表明：（1）打孔法操作简单、方便快捷，获得的抑菌圈质量高、重复性好，是优先选用的方法；（2）牛津杯法获得的抑菌圈质量较高，重复性较好，但在放置牛津杯、加注药品的时候要小心，以免药物渗漏，将试验平板移动至培养箱的过程中要避免牛津杯的打翻；（3）K-B法操作简单、方便快捷，获得的抑菌圈质量较高，但重复性不佳，不适宜进行定量试验，只适宜进行定性试验。

3种方法获得的抑菌圈其形状均比较理想，抑菌圈直径大小分别是：K-B法16.84 mm、牛津杯法18.36 mm、打孔法22.58 mm。对于K-B法，其操作简单、方便快捷，被研究者广泛利用，但由于浸泡药品时很难控制药品在滤纸片上的吸附量且重复性较差，因此不适宜于定量试验，只适合于定性试验。对于牛津杯法，其是国内外测定抗生素效价的通用方法，通过试验，获得的抑菌圈质量较高，重复性较好；其不足是放置牛津杯时，很难掌握力度以保证每个牛津杯与试验平板接触情况的一致性，而且加完样品然后转移至培养箱的过程当中，由于试验人员的不小心或其它原因，会导致牛津杯的移动或松动甚至倒翻，对试验结果造成很大的影响。对于打孔法，此次试验结果获得的抑菌圈质量高、重复性好，抑菌圈直径是最大，其基本能解决K-B法和牛津杯法中不足的地方，且其操作简单方便，越来越受试验人员青睐；需要注意的是打完孔后挑去孔中培养基小块的时候，一定要小心操作，如果用力不当，会破坏孔的完整性，导致抑菌圈形状不规则。

另外，在测量抑菌圈直径大小的时候，这3种方法当中，打孔法的误差最小，原因是K-B法和牛津杯法的试验平板中，由于药物是从培养基表面向四周呈球形扩散（如图7所示），培养基越厚，培养基表面与底部的浓度差越明显，造成表面和底部所形成的抑菌圈直径大小不一样，对试验人员的测量工作造成一定的影响；而打孔法的药物是直接向四周的培养基均匀扩散（如图7所示），培养基表面和底部的抑菌圈大小保持一致，避免了前两种方法中由于试验人员人为的观察差异而导致测量误差。

在进行抑菌圈法试验时，还应考虑以下几点：一是试验平板的制备，经过试验，预加菌液倾注平板法的效果最好，相对倾注平板法和涂布平板法而言，能有效保证试验平板中菌落的均匀性、均一性，且重复性好。二是应考虑试验平板中菌落的浓度，试验结果显示，试验平板中菌体浓度在1×10^5~1×10^6 CFU/mL时，平板菌落浓度致密，抑菌圈界限明显，是进行抑菌圈试验的适合菌体浓度。三是加入试验药物后应进行预扩散，试验结果显示，在4 ℃条件下预扩散2 h左右比较适合。四是抑菌药物应选择适宜的浓度，其浓度应使抑菌圈直径在18~22 mm，过小会增加测量的误差，过大的话，如果在一个试验平板中用多个孔（或多个牛津杯）进行多浓度试验时，会造成抑菌圈交叉，影响试验结果。五是应考虑培养基的pH，因为有些抑菌药物在偏酸性和在偏碱性的条件下，其抑菌效果差异较大；另外不同的pH对微生物的生长影响是有差异的；再有就是在弱碱性条件下，培养基硬度较
好，有利于打孔法中培养基小块的挑出。