[科普中国]-血浆蛋白结合率

血浆蛋白结合率（binding rate of plasma protein， BRPP）是指药物吸收入血液后，多数与血浆蛋白结合，治疗剂量的药物与血浆蛋白结合的百分率1。

在正常情况下，各种药物以一定的比率与血浆蛋白结合，在血浆中常同时存在结合型与游离型。而只有游离型药物才具有药物活性。当两种药物联合应用时蛋白结合能力较强的药物分子占领结合部位，使其他药物不能得到充分的结合，以致后者的游离部分增多，药效增强。这种相互作用对一些蛋白结合率较高的药物具有意义，因此要注意那些药效较强烈或毒性较大的药物，以防止药物自结合部位置换下来，使药效增强，常具有一定的危险性。

特点血浆蛋白结合率为可逆性疏松结合，结合型药物分子量增大，不能跨膜转运、代谢和排泄，并暂时失去药理活性，某些药物可在血浆蛋白结合部位上发生竞争排挤现象。药物分子与血浆蛋白结合的特点（和药物与受体蛋白结合情况相似）：具有饱和性与可逆性、结合物无活性、有竞争置换现象。

测定方法平衡透析法平衡透析法是定量研究蛋白质与小分子结合平衡的一种传统且成熟的膜分离技术。平衡透析法的工作原理是基于分子大小或者重量不同，将大分子溶液和小分子溶液分别置于只允许小分子透过而不允许大分子透过的半透膜两侧，它是在无外力驱动条件下，药物分子扩散透过半透膜，当透析达到平衡时，测定膜两侧溶液中小分子的浓度，通过计算即可分析得大分子与小分子结合的数据。该方法在溶液中完成，血浆和缓冲液的pH值以及离子强度保持相对恒定，可以最大限度反映体内情况，结果可靠，故经常作为经典参比方法。龙友琦等2采用平衡透析法测定了不同浓度下丙泊酚微乳注射液的血浆蛋白结合率。结果证明丙泊酚微乳注射液属于高蛋白结合药物，应用时应充分考察药物联用时其对蛋白结合率的影响，保证人体用药的安全。

平衡透析法存在耗时过长的缺点，通常需要12-48h。半透膜与蛋白质易产生体积迁移效应，对于带电的蛋白质可能产生Gibbs-Donna效应3以及非特异性的透析设备表面的药物吸附效应。目前商品化96孔平衡透析装置应用于血浆蛋白结合率的测定，该装置能够减少非特异性的透析设备表面的药物吸附，并且能够加速待测样品的溶解，缩短平衡时间，提高样品分析的通量。此外，平衡透析法结合电化学发光4，荧光以及质谱等高灵敏度检测方法已经应用于血浆蛋白结合率的测定。周玲玲等4采用传统的平衡透析方法，利用毛细管电泳-电化学发光技术成功的测定了丙吡胺与人血浆蛋白的结合率。

微透析法微透析技术是一种活体细胞外液的生化物质采样分析技术。因其独有的微创性和取样的连续性，现已被广泛应用于脑组织各种病理生理现象的探索性实验、神经生物化学的检测和药物代谢研究5。微透析法用于药物血浆蛋白结合率测定，基于药物与大分子蛋白结合后不能穿透具有一定相对分子质量截留值的微透析的半透膜，而游离药物可通过半透膜，从而间接测定药物的血浆蛋白结合率。因其采集的多为不能透过透析膜的小分子物质，即游离药物，故可以进行实时的蛋白结合率研究[。微透析取样造成的药物损失可以忽略不计，使测定结果更为准确；极少的药物采样量和采样体积保证采样过程中浓度始终恒定是其相较其他蛋白结合率测定方法的优越性所在。张英丰等6利用微透析技术进行采样，运用HPLC-UV检测，采用零净通量法测定了高、中、低浓度下盐酸青藤碱的大鼠离体血浆蛋白结合率。但是，此法只可测定药物的游离浓度，而得不到总浓度或结合药物浓度的信息。

近年来，微透析与高效液相色谱、毛细管电泳或质谱等分析仪器联用在生命过程动态变化的研究中显示出很好的发展前景。董文彬等7采用微透析结合高效液相色谱技术，测定米诺环素与大鼠血浆蛋白结合率，获得了米诺环素在大鼠血液和脑内的药动学参数。

超滤法超滤法与平衡透析法相似，也是研究蛋白质与小分子结合作用的常用方法8。该方法是在压力差的驱动下，药物分子扩散透过半透膜。超滤法的最大优点是实现血浆中游离小分子的快速分离、用时短，与平衡透析法相比，大大提高了分离速率。但该方法也同样存在Gibbs-Donna效应、非特异性的透析设备表面的药物吸附效应以及蛋白质泄漏9等缺点。由于该方法操作简单、分析快速以及商品化96孔平衡透析装置的应用，超滤法可用于药物筛选，疗效追踪以及临床药理与药效学研究中大规模生物样品的游离药物浓度分析和药物蛋白结合率的测定。

此外，陈莹等10采用超滤法结合高效液相色谱法(HPLC)对冬凌草甲素与大鼠、家兔和健康人血浆的蛋白结合率进行测定。结果表明此法简便快速、灵敏度高、专属性好，能够满足测试生物样品的要求。

超速离心法超速离心法的基本原理是在一定的离心力场的作用下，根据小分子与蛋白质在液体介质中沉降速度或密度不同而停留在液体介质中不同的位置而分离的方法。在药物蛋白结合率的测定中，蛋白结合的药物形成沉淀，游离的药物小分子在离心管的上清液中被定量测定。此法的优点是克服了Gibbs-Donna效应以及膜吸附效应等与透析膜有关的缺点。李秋红等11采用超速离心法除掉血浆蛋白，并用高效液相色谱法对高、中、低剂量给药后的丁香苦苷血药质量浓度进行测定。结果证明丁香苦苷血浆蛋白结合率不具有质量浓度依赖性，丁香苦苷临床用药有较好的安全性。

与平衡透析法相比，该方法使用的仪器较贵，沉降、反向扩散及黏度等物理现象影响游离药物浓度准确定量，因而限制了该方法的应用。

以光谱学为基础的方法光谱技术也多用于药物血浆蛋白结合常数测定。药物与蛋白质结合生成超分子复合物后，体系的光谱、电化学性质发生改变，从而提供蛋白质浓度或结构方面的信息12。常用的光谱法包括紫外-可见吸收光谱法(UV-visible)，荧光光谱法(fluorescence)，红外光谱法(infrared)，元二色谱法(circulardichroism，CD)，旋光法(opticalrotatorydispersion，ORD)以及核磁共振法(NMR)。利用这些方法除了可以测定药物与蛋白质结合率，还可以获得蛋白质和药物的结合位点数、结合位置、作用力类型以及在药物作用下蛋白质结构与功能变化的信息。光谱学技术不适合研究多平衡体系。

荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少等优点，因此在研究小分子与蛋白质的相互作用中，荧光光谱法占有重要地位。但该法需要经过大量的计算，较其他方法不简便、不直观。

表面等离子体子共振技术是近年来研究很热门的一种新技术，它采用的也是基于光谱技术的一种方法。它的基本原理是当一定特定角度的入射光进入感应片的玻璃棱镜内时，产生的全内反射消失波，与表面等离子体将发生共振，入射光被吸收，导致反射光能量急剧下降，因此反射光谱上出现共振峰(即反射强度最低值)。表面介质折射率的任何微小改变都将使入射角度发生迁移，这种变化被探测器捕获，并转化为相应谱图。利用表面等离子体共振技术研究药物与蛋白的作用情况，具有不需标记及检测快速等优点。但该法所用的仪器都较复杂，价格也较昂贵，难于小型化。迄今，这一技术已在抗体-抗原反应研究、模拟细胞膜与药物作用机理研究、DNA与蛋白质相互作用分析及病毒测定研究等方面取得不少成果，在食品、药物、生物技术及生物制药等领域也越来越受到重视。

高效亲和色谱法高效亲和色谱法用于测定药物与血浆蛋白的结合，可由药物的迁移变化率的连续变化计算出药物与蛋白的结合常数。色谱系统良好的精密度和重现性可提供大量结合作用的对比研究，并易于与MS等技术联用。该方法允许多种药物同时进样，并可同时测定多种药物与蛋白的结合常数，对立体选择性蛋白结合的研究非常有用。

高效亲和液相色谱法是研究小配体与生物大分子之间相互作用的有力工具，其固定相是固定化的生物高聚物(酶、受体、离子通道或抗体)。亲和毛细管区带电泳在研究药物蛋白结合作用方面具有分离效率高、扩散系数小、样品用量少、仪器操作简单，可以采用与活体生理条件相同(或相似)的体系进行研究等优点。

微量热法微量热法是近年来发展起来的一种研究生物热化学与生化过程动力学的重要方法，该法对反应体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，在测定中也不需添加任何试剂，不会干扰生物体系的正常活动与代谢，已被先后用于一些抗肿瘤药物、生物染料、药物小分子与DNA或蛋白质的相互作用。

研究趋势近年来，随着药动学的深入研究，药物与血浆蛋白的结合率已成为药学领域中的研究热点，特别是对于那些血浆蛋白结合率高的药物。平衡透析法虽然操作复杂且费时，但是分析成本低，可以直接得到游离小分子的浓度，仍然为常规的测定方法。光谱法可以测定药物与蛋白质结合率，此外还可以获得蛋白质和药物的结合位点数，结合位置，作用力类型以及在药物作用下蛋白质结构与功能变化的信息，但光谱学技术不适合研究多平衡体系。色谱法是近年来研究药物与血浆蛋白结合率发展最快的方法，特别是毛细管电泳法具有操作简单、分离效率高、样品用量少以及研究可以在近生理环境中进行等优点，已经成为研究药物蛋白结合作用的有效方法，正在被广泛地研究与应用。但是毛细管电泳法常规的紫外检测器的灵敏度较差，限制了低药物浓度与蛋白结合作用的应用研究，因此发展高灵敏度检测器仍然是毛细管电泳领域研究的热点13。