[科普中国]-三维光学显微成像

三维光学显微成像是利用光学层析技术获取样品三维图像的光学显微成像方法。实现三维光学成像的显微镜必须具有区分成像焦面的有用信号与焦面外的背景信号的能力，即光学层析能力。通过移除焦面外的信号，显微镜可以获取厚样品中一系列的薄层信号。基于这些二维的图像，计算机技术可以重构出反映样品信息的三维图像。获取层析能力主要有两种方式：一种方式是在照明的过程中不产生焦面外的背景信号；另一种方式是在探测前或探测后移除焦面外的信号。基于这两种方式，科学家们发展出了不同的光学显微成像方法。根据光学层析机理的不同，这些方法主要有激光共聚焦显微成像、非线性光学显微成像、结构光照明显微成像与光片照明显微成像。[1-3]

激光扫描共聚焦显微成像

图1 共聚焦显微成像示意图

在传统的宽场显微成像中，整个样品被光源均匀地照亮，样品不同位置发出的荧光同时被探测器接收，其中包括大量的焦面外的信号。在对厚样品成像时，焦面上的信号只占探测信号的一小部分，因此图像会非常模糊。不同与宽场成像，激光共聚焦显微成像采用点扫描的方式，并且在探测器前成像焦面的共轭面上放置小孔，以阻挡焦面外产生的信号进入探测器（如图1所示）。由于小孔的作用，只有焦平面上的信号可以被探测到，因此这种成像方式具有层析能力。

共聚焦成像能够获取高质量的图像，目前被广泛应用在科学与工程领域中，其典型应用包括生命科学、半导体检测与材料科学。

非线性光学显微成像1. 双光子激发显微成像双光子激发显微成像是利用双光子激发的非线性效应实现其内在的层析能力的。双光子激发的概念最早由Maria Goeppert-Mayer于1931年在她的博士论文中提出。

图2 单光子与双光子激发的能级和效果示意图

荧光物质同时吸收两个光子后能够激发出荧光光子，荧光光子的能量比这两个光子的能力要高。由于同时吸收两个光子的概率比较低，这种成像采用聚焦脉冲激光的方式来激发荧光，以在短时间内在焦点处聚集大量的激发光子。双光子激发依赖于同时吸收，激发的荧光强度正比于激发光强度的平方。这种非线性效应使得只有在焦点处很小的体积内能够激发荧光，样品其它区域不能够激发荧光，因而这个成像方式具有内在的层析能力。图2中对比了单光子与双光子激发的能级跃迁和激发效果。

双光子激发通常采用近红外波段的激光进行激发，这样成像的穿透深度比较深，光漂白也比较小，适合于对活体生物组织进行非侵入式的光学成像。目前双光子激发显微成像被广泛应用在生理学、神经生物学、胚胎发育学中。

2.二次谐波显微成像

图3 二次谐波产生的能级示意图

二次谐波（也称做“倍频”）是一种非线性的光学效应。在这种现象中，同一频率的两个光子与非线性材料进行相互作用后被“结合”产生一个光子。这个光子具有两倍的原光子的频率，波长精确地为原光子波长的一半（如图3所示）。二次谐波成像是基于二次谐波效应的成像方法。与荧光成像的对比度来源于荧光分子密度不同，其对比度来源于样品产生二次谐波能力的变化。

与双光子激发成像一样，二次谐波成像也使用近红外波段的脉冲激光，因此二次谐波成像具有无需标记和底损伤性的优点，其常常与双光子激发成像一起用来对活体组织进行多模式成像。二次谐波具有偏振各向异性的特点，因此可以用于探测蛋白质分子的排列方向。

结构光照明显微成像

4 结构光照明显微成像示意图

结构光照明显微成像是在宽场成像的基础上发展出的三维层析成像方式。在这种成像方法中，照明光路中放置了光栅，最终在物镜后成像焦面上产生了强度为正弦分布的照明。通过改变正弦分布的相位并记录调制后的反射或荧光图像可以提取出成像焦平面的图像和抑制焦面外的模糊（如图4所示）。这种层析能力的获取是基于后期的计算处理。这种层析成像方法为后来的超分辨技术奠定了物理基础。

由于只需要对传统的宽场显微镜进行照明光路的改进便可以获取层析能力，结构光照明层析成像具有成本低的优势。目前发展的快速结构光照明成像可用于对生物组织动态事件进行监测。

光片照明显微成像

图5 光片照明显微成像示意图

光片照明显微成像，也称作选择性平面照明显微成像。与传统的落射式照明成像不同，这种成像方式是从样品的侧面进行照明，照明方向垂直于探测方向。这样样品中只有一个薄层被照亮，使得成像具有层析能力，移动光片的位置可以获取样品的三维图像。产生光片的方式有主要有两种：第一种是用柱透镜使光束在一维上聚焦；第二种方式是在一维上扫描光束形成光片。

由于只有需要观察的平面被照明，这种成像方法减少了对样品的光漂白，适合应于对样品的长时间的成像。另外由于使用面阵探测器进行成像，其成像速度较快。目前，光片照明成像通常被应用在发育生物学中，用以对胚胎的发育进行长时间的观察。