[科普中国]-保健食品中前花青素的测定

范围

本标准规定了保健食品中前花青素的测定方法。

本标准适用于以葡萄籽、葡萄皮、沙棘、玫瑰果、蓝浆果、法国松树皮提取物等为主要原料制造的保健食品中的前花青素的测定。

本标准的检测限：方法的检出限（LOD）为1.5×10-4g/100g；方法的定量限（LOQ）为5.0×10-4g/100g。线性范围为10µg/mL~150µg/mL。

原理前花青素易溶于水，是黄烷-3-苯儿茶酚和表儿茶精连接而成，依据试样中前花青素前体或聚合物在加热的酸性条件和铁盐催化作用下，C-C键断裂生成深红色花青素离子即氰定的原理，使用高效液相色谱，利用C18反向柱分离，在波长525nm下检测，根据保留时间定性，外标法定量，测定试样中前花青素含量。

试剂和材料1、甲醇（CH3OH）：分析纯

2、甲醇（CH3OH）：色谱纯

3、正丁醇(CH3(CH2)2CH2OH)：分析纯

4、盐酸（HCl）：分析纯

5、二氯甲烷（CH2Cl2）：分析纯

6、异丙醇(CH3)2CHOH）：分析纯

7、甲酸（HCOOH）：分析纯

8、硫酸铁铵(NH4Fe(SO4)2·12H2O)：分析纯

9、水（H2O）：为实验室一级用水，电导率（25℃）为0.01mS/m

10、2%硫酸铁铵(NH4Fe(SO4)2·12H2O溶液：称取硫酸铁铵2g，用浓度为2mol/L盐酸溶解，定容至100mL。

11、前花青素标准品浓度≥98%

12、前花青素标准溶液（1.00mg/mL）：称取0.01g前花青素标准品（精确至0.0001g），用色谱纯甲醇溶解并定容至10mL，棕色容量瓶中，此溶液现用现配。

仪器和设备1、高效液相色谱仪：配有紫外检测器。

2、超声波清洗器。

3、离心机：4 000 r/min。

分析步骤1、试样处理

（1）片剂：取20片试样，研磨成粉状。

（2）胶囊：取20粒胶囊内容物，混匀。

（3）软胶囊：挤出20粒胶囊内容物，搅拌均匀，如内容物含油，应将内容物尽可能挤完全。

（4）口服液：摇匀后取样。

2、提取

（1）固体粉状试样：根据试样含量称取50 mg～500 mg(精确至0.001 g)试样于50 mI。棕色容量瓶中，加入30 mI分析纯甲醇，超声处理20 min，放冷至室温后，加分析纯甲醇至刻度，摇匀，离心(3 000 r/min，10 min)或放置至澄清后取上清液备用。

（2）含油试样：根据试样含量称取50 mg～500 mg(精确至0.001 g)试样置于小烧杯中，用5 mI。二氯甲烷使试样溶解，并倒入50 mI。容量瓶中，再用分析纯甲醇多次洗烧杯，并倒入50 mL棕色容量瓶中，用分析纯甲醇定容至刻度，摇匀。

（3）口服液：根据试样含量准确吸取1 mI～5 mL样液，置于50 mL容量瓶中，加分析纯甲醇至刻度，摇匀。

3、水解反应

将正丁醇与盐酸按95：5的体积比混合后，取出15 mL置于具塞锥瓶中，再加入0.5 mI硫酸铁铵溶液和2 mI试样溶液，混匀，置沸水浴回流，精确加热40 min后，立即置冰水中冷却，经0.45μm滤膜过滤，待进高效液相色谱分析。

4、标准曲线制备

吸取标准溶液0.10、0.25、0.50、1.0、1.5 mI．置于10 mL棕色容量瓶中，加分析纯甲醇至刻度，摇匀。各取2 mL测定，处理方法同上，以峰高或峰面积对浓度作标准曲线。

5、液相色谱参考条件

（1）色谱柱：耐低pH型的ODS C18柱，4.5 mm×150 mm，5μm。

（2）柱温：35℃。

（3）检测器：紫外检测器。

（4）检测波长：525 nm。

（5）流动相：水+甲醇(色谱级)+异丙醇+甲酸=73+13+6+8。

（6）进样量：10μL。

（7）流速：1.0 mL/min。

（8）色谱分析：取标准溶液及试样溶液注入色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰高或峰面积与标准比较定量。

6、 注意事项

实验过程中应避免阳光直射。

结果计算试样中前花青素的含量按式(1)进行计算：

X=X1×V×f/m （1）

式中：

X——-试样中前花青素的含量，单位为克每千克或克每升(g/kg或g/L)；

X1——从标准曲线上得到的含量，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

V——试样定容体积，单位为毫升(mL)；

f——稀释倍数；

m——试样的质量(或体积)，单位为克或毫升(g或mL)。

计算结果保留三位有效数字。

精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%1。

色谱图在上述色谱条件下的色谱图见图1～图2。