[科普中国]-产甲烷菌

简介

产甲烷菌是一类能够将无机或有机化合物厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳的古细菌。产甲烷菌是重要的环境微生物，在自然界的碳素循环中起重要作用。1

1979年，Balch和Wolfe通过16S rRNA测序 将产甲烷菌发展为3目（甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目）4科7属14种。1993年，Boone将甲烷八叠球菌科上升为一个目，建立了火热产甲烷菌目，至此产甲烷菌发展为5目10科25属59种。2001年，Bergey's Manual of Systematic Bacteriology将产甲烷菌放在宽广古生菌门（Euryarchaeota）中，至此产甲烷菌发展为3纲，5目，10科，26属，78种。产甲烷菌属于古菌域（Archaea），广域古菌界（Euryarchaeon），宽广古生菌门（Euryarchaeota）。人们对产甲烷菌的认识约有150年的历史。人们对产甲烷菌有极大的兴趣是在于产甲烷菌对天然气的形成，在自然界与水解菌和产酸菌等协同作用，使有机物甲烷化，产生有经济价值的生物能物质——甲烷。

分类产甲烷菌是严格厌氧的微生物，在严格厌氧技术发明之前，产甲烷菌的分离培养研究进展缓慢。巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)和甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicium)是最早分离出的产甲烷菌微生物；1950 年 Hungate 厌氧分离技术的使产甲烷菌的研究得到迅速的发展。1974年《伯杰氏鉴定细菌学手册》第八版以产甲烷菌的形态作为分类依据，将其描述为一个独立的科。2第九版《伯杰系统细菌学手册》中产甲烷菌的分类以系统发育的方法划分，包括 5 个大目：甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷 八 叠 球 菌 目(Methanosarcinales)、甲 烷 微 菌 目(Methanomicrobiales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)(Liu and Whitman, 2008; 陈森林, 2010)，每个目的产甲烷菌包含多个科属，现已命名的 10 科、31 属分属上述5个目的产甲烷菌。3

近年来，随着厌氧分离技术的改进，结合先进的鉴定手段和分析方法，更多种类的产甲烷菌菌株被鉴定出来。在分类学上，产甲烷菌被分别描述为甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、甲烷球菌纲(Methanococci)、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)和甲烷火菌纲(Methanopyri)，这4 个纲包括 7 目、14 科、35 属。其中甲烷微菌纲(Methanomicrobia)有 4目、9科、25属，是研究最多的产甲烷微生物类群。4

甲烷生成途径研究甲烷的生物合成有 3 种途径，包括以乙酸为底物，以 H2/CO2 为底物，以甲基类化合物为底物的生物合成过程。研究表明，以乙酸盐为底物产生的甲烷占自然界甲烷量的 67%，而以 H2/CO2转化形成的甲烷不足自然界甲烷量的33%。很多独特的酶类参与甲烷生成过程，这些酶类主要有氢化酶、辅酶F420、甲酰甲基呋喃、甲酰四氢甲基喋呤、辅酶 M 等，通过监测产甲烷过程中的独特酶类，可以从本质上认识产甲烷菌的代谢规律。三种甲烷合成途径最终都形成甲基辅酶 M，甲基辅酶 M 在甲基辅酶 M 还原酶Ⅰ (MCR Ⅰ)和甲基辅酶 M 还原酶Ⅱ (MCR Ⅱ)的催化下最终形成甲烷。4

细胞结构

产甲烷菌的细胞结构：细胞封套（包括细胞壁、表面层、鞘和荚膜）、细胞质膜、原生质和核质。

产甲烷菌有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，它们的细胞壁结构和化学组分有所不同。也是与真细菌的区别点。

细胞封套有四种：

1.大多数G+产甲烷菌的细胞壁在结构上与G+真细菌相似，细胞壁有一层和三层的，单层的厚度为10～20nm，如甲烷杆菌属与甲烷短杆菌属。巴氏甲烷八叠球菌的细胞壁只有一层，厚约200nm。它们化学成分与G+真细菌的不同，不含细胞壁（即不含二胺基庚二酸或细胞酸）而是假细胞壁质或是未硫酸化的异多糖。三层的细胞壁壁厚为20～30nm，有内层、中层和外层。外层在细胞分裂横隔形成时消失，如瘤胃甲烷短杆菌。

2.G+的炽热高温甲烷菌的细胞壁外有一层六角形的蛋白质亚基即S层覆盖。

3.G-产甲烷菌不具有球囊多聚物或外膜。只有一层六角形或四角形的，由蛋白质亚基或糖蛋白亚基组成的S层。

4.甲烷螺菌的细胞质膜外只有一层由蛋白纤维组成的鞘包裹几个细胞。其厚度为10nm。

生理特性1.营养特性：甲烷细菌的能源和碳源物质主要有5种，即H2/CO2、甲酸、甲醇、甲胺和乙酸。

2.特殊辅酶：F420：是黄素单核甘酸的类似物，分子量为630的低分子量荧光化合物。它是甲烷细菌持有的辅酶，在形成甲烷过程中起着重要作用。

其特点：(1)当用420nm波长的紫光照射时，能产生自发蓝绿荧光，这一现象可借以鉴定甲烷细菌的存在。（2）中性或碱性条件下易被好氧光解，并使酶失活。

CoM:2-巯基乙烷磺酸.

其特点：（1）它是甲烷细菌独有的辅酶，可借以鉴定甲烷细菌的存在。（2）它在甲烷形成过程中，起着转移甲基的重要功能。（3）其具有RPG效应.。即促进CO2还原为CH4的效应。

3.环境条件：氧化还原电位：参与中温消化的甲烷细菌要求环境中应维持的氧化还原电位应低于一350mV；对参与高温消化的甲烷细菌则应低于-500~-600mV。

温度：低温菌的适应范围为20~25°C，中温菌为30~45°C，高温菌为45~75°C。

pH：大多数中温甲烷细菌的最适pH值范围约在6.8~7.2之间。

毒物：凡对厌氧处理过程起抑制或毒害作用的物质，都可称为毒物。

培养方法产甲烷菌是专性厌氧菌，它分离和培养等的操作均需要在特殊环境和用特殊的技术进行。

培养方法分类一般要求不高的可用在液面加石蜡或液体石蜡的液体深层培养法、抽真空的培养法、在封闭培养管中放入焦性没食子酸和碳酸钾除去氧的培养方法（Berker）、Hungate的厌氧滚管法、Hungate的厌氧液体培养法、Balch的厌氧液体培养增压法等。

具体方法介绍目前最好的是厌氧手套箱，它由四部分组成：

1.附有手套的密闭透明薄膜箱

2.附有两个可开启的可抽真空的金属空气隔离箱

3.真空泵

4.氢和高纯氮的供应系统

利用厌氧手套箱可做许多工作，如：分装厌氧培养基，倒制平板，离心厌氧微生物收集菌体，对氧敏感的酶和辅酶的分离纯化，进行电泳、厌氧性生物化学反应和遗传学研究等。