[科普中国]-荧光定量PCR

荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-qPCR or qPCR)， 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度1。

原理荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线1。

2个概念①荧光域值(threshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍1。

②Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数1。

3个阶段①荧光背景信号阶段：在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化1。

②荧光信号指数扩增阶段：只有在荧光产生进入指数期， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含量而进行定量分析。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。通过已知起始拷贝数的标准品可得到标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数1。

③平台期：在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA拷贝数1。

分类荧光化学分类实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I法和Tag Man探针法。

①SYBR Green I法：SYBR Green I是一种具有绿色激发波长的染料，最大吸收波长约为 497 nm，发射波长最大约为 520 nm，可以和所有的 dsDNA 双螺旋小沟区域结合。因为在游离状态下 SYBR Green I 发出的荧光较弱，但是当它与双链 DNA 结合后，荧光就会大大增强，而且荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。此法的优点是它可以监测任何 dsDNA 序列的扩增，检测方法较为简单，成本较低，但也正是由于荧光染料能和任何dsDNA 结合，如非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合而产生荧光信号，使实验产生假阳性结果，因此其特异性不如探针法。因为非特异性产物和引物二聚体的变性温度要比目标产物的低，所以可以在熔解曲线反应过程中利用软件分析仪器收集到信号进行鉴别1。

②TaqMan探针法：TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量 PCR 技术。它的工作原理是在 PCR 反应体系中存在一对 PCR 引物和一条探针，探针的5′ 端标记有报告基团，3′ 端标记有荧光淬灭基团，探针只与模板特异结合，其结合位点在两条引物之间。当探针完整的时候，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，所以仪器搜集不到信号，随着反应的进展，Taq酶遇到探针，利用 3′→5′ 外切核酸酶的活性把探针切断，导致报告基团的荧光能量不能被淬灭基团吸收，产生了荧光信号，因此信号的强度就代表了模板 DNA 的拷贝数1。

定量方法分类在实时荧光PCR中。模板的定量有2种方法：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过已知的标准曲线来确定我们所感兴趣基因的拷贝数；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化2。

①绝对定量：用已知的标准曲线对未知样本的量进行推算的方法为绝对定量法。此种方法需要明确标准样品的浓度情况，然后稀释标准样品，分为几个不同梯度浓度然后进行反应测试。横坐标为标准品拷贝数的对数值，纵坐标为测得的Ct值，进而绘制出标准曲线。以标准曲线为基础，在定量分析未知样品过程中根据其ct值能够将样起始拷贝数推算出2。

②相对定量：相对定量法又分为两种。

比较标准曲线的相对定量法：在一定样本中，靶序列相对于另一参照样本量变化情况进行分析的方法为相对定量法。在采用该方法过程中，需要有参照物，所以较容易绘制定量标准曲线，只要将标准品稀释度确定便可进行对比分析2。

比较Ct值的相对定量法：此方法是将待测靶基因片段和内参照基因片段同时扩增，可以在两个反应管中或者一个反应管中进行扩增反应，并且就两者的ct值之差进行测量。在采用此方法过程中需要用数学公式进行相对量的计算，首先要假设每个循环产物增加一倍时PCR反应指数期得到Ct值对起始模板的量一个循环的估算和起始模板数两倍相当。这种方法的前提是靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致，所以在应用过程中效率的偏移会对实际拷贝数估计产生一定影响，因此，为了保证目的基因和内参基因的扩增效率相等应当加强对反应体系的优化，这也是该方法应用的难点之一2。

特点实时荧光定量PCR技术总结为以下几点。

1.特异性强

2.灵敏度高

3.重复性好

4.检测速度快

5.自动化程度高

应用领域实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精确性高的优点，此项技术已被应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个领域1。

在分子生物学领域的研究应用①定量核酸浓度：传统方法是用琼脂糖凝胶电泳或者分光光度计测定核酸浓度，其结果不准确而且易污染，实时荧光定量PCR可以解决这些问题，它的准确性、灵敏度高且无污染，对一些传染性疾病进行定量分析、病原微生物和病毒含量检测，此项技术都是首选1。

②研究基因表达：应用实时定量PCR技术可以对基因时间、空间表达水平差异进行比较。例如，对特定基因用物理、化学、药物等不同方法处理后的差异进行比较，为人们的科学研究提供依据1。

③用于单核苷酸多态性(SNP)检测分析：人们对疾病的易感性和对同一种药物治疗同一种疾病的效果是有差异性的，遗传物质DNA的多态性RELP，STR，ABO血型和SNP是个体差异的遗传基础。SNP在人类基因组中广泛存在，是人类可遗传变异中最常见的一种，在遗传性疾病的研究中具有重要意义1。

④DNA甲基化检测：DNA甲基化是表观遗传学重要的标记信息，通过实时荧光定量PCR技术获得基因组甲基化水平数据对表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义1。

在医学领域的研究应用①用于病原体检测：常规PCR不能定量，在操作中易污染导致出现假阳性结果，应用实时荧光定量PCR技术可以解决这些问题。目前，此项技术已应用于检测丙肝病毒、宫颈癌及其癌前病变有关的人类乳头瘤病毒、抗结核药物治疗后定量检测病人痰样本病原体DNA含量，为疾病的诊断和治疗提供依据。用此项技术还可以一次性检测大量大肠杆菌样本，简便准确，是食品检测方面的一个突破1。

②肿瘤基因检测：肿瘤发生机制非常复杂，发病机理尚未清楚，随着基因分子水平研究不断发展，肿瘤基因发生突变等遗传学改变是致癌性发生的根本原因已被广泛接受。癌基因表达异常和突变在多种肿瘤早期和良性阶段就已出现，通过实时荧光定量PCR检测可检测到基因突变，准确测定其表达量，为肿瘤早发现、早诊断、早治疗及疗效和预后的判断提供依据1。

③用于药物选择和疗效判断：化疗过程中主要问题是病人对化疗药物的耐药，检测肿瘤耐药基因的表达水平是选择化疗药物的依据。检测微小残留病变的变化情况对于调整治疗策略和对病人进行个体化治疗非常重要1。

④用于优生优育诊断：唐氏综合征是由染色体异常所导致的，在产前通过实时荧光定量PCR技术做染色体核型分析，可以最大限度地防止患儿的出生，是防止此病的有效措施。此项技术还可以对孕产妇进行叶酸利用能力检测，为孕产妇提供叶酸补充具有指导意义。此项技术对于降低严重缺陷儿出生率、提高人口素质起到了积极的推动作用1。

在食品检测方面的应用①微生物：食品安全是与人民群众生活息息相关的问题。食品在生产、储藏、运输、销售等一系列过程中不可避免地存在受到微生物污染的可能性，荧光定量PCR技术用于检测食品中的致病菌1。

②转基因：利用荧光定量PCR技术将转基因信号扩增放大。

在环境监测方面的应用实时荧光定量PCR技术已经被国内外应用在环境监测中，提高了监测水平。此项技术可以检测河流中环境微生物随着季节变化的情况。还可以用来对地表水和饮用水中致病菌进行检测以便及时预告地表水污染情况以及采取相应有效措施避免大范围污染1。

注意事项1.仪器摆放：实时荧光定量 PCR 仪应安放在湿度较低、灰尘较少、远离水池的平稳台面上，不能有强光直射，室内应通风良好，无腐蚀性气体3。

2.温度设置：在设置荧光 PCR 程序时，要仔细核对程序中的目标温度、恒温时间和循环次数等参数，参数设置不正确将直接影响 PCR 检测结果。延伸过程中要设置读取收集荧光信号，如不设置收集荧光，将无法保存试验数据，无法判定检测结果，造成试验失败3。

3.操作规范：在对样品进行核酸提取和实时荧光扩增时要规范操作，防止样品的交叉污染、 酶的降解、假阳性的出现3。

①离心管、枪头和 PCR 管均需要高压灭菌或使用商品化的无 污染的离心管、枪头和PCR 管。

②核酸提取结束后应立即进行仪器扩增，提取的核酸不可长时间置于室温，易受空气中酶的降解，短期可保存于 －20 ℃冰箱，长期应保存于－70 ℃冰箱3。

③使用可高压处理的移液器，由于移液器容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染，因此要使用可高压处理的移液器3。

④严格按照试验的分区进行操作，按照提取区、扩增区、检测区单方向流动，物品、样品和试剂不可逆向流动3。

⑤操作多份样品时，制备反应混合液，先将荧光 PCR 反应液、荧光探针和酶混合好，然后分装到每个 PCR 管中，这样即可以减少操作次数，避免污染，又可以增加反应的精确度3。

⑥在加样品、加蛋白酶 K 和加样品过程中，特别注意防止样品的交叉污染和酶的降解3。

⑦操作时设立阴性及阳性对照，可验证荧光 PCR反应的准确性和可信性3。

本词条内容贡献者为:

成玉林 - 副教授 - 重庆大学