[科普中国]-双分子荧光互补-

双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC)技术是指通过具有相互作用亲和力的两个蛋白质，将分别与其相连的荧光蛋白片段拉近，组装成完整的荧光蛋白，从而表征蛋白质相互作用的发生及其空间位置1。

原理双分子荧光互补技术本质上是一种蛋白质片段互补技术，是指将荧光蛋白多肽链在某些不保守的氨基酸处切开，形成不发荧光的 N-和 C-末端2 个多肽片段。将这 2 个荧光蛋白片段分别连接到 1 对能发生相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这 2 个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的 2 个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光2。

特点可视化可视化是 BiFC 技术最大的特点。在此技术中，荧光蛋白由于相互靠近而重新构成能发出荧光的蛋白，这种荧光是自我催化的结果，不需要底物与辅助因子，非常稳定，而且通过荧光显微镜和流式细胞仪等常规仪器很容易检测到BiFC 信号，这种直观性使得 BiFC 技术在短短几年迅速获得应用，已经成为检测活体细胞中蛋白质相互作用的一种常规方法。这种可视性既可以直观地观察到蛋白的相互作用，而且还能通过对这种可视化的荧光进行定量从而确定蛋白相互作用的强弱，极大地方便了蛋白相互作用之间的研究2。

可以应用到不同的宿主细胞中荧光蛋白结构稳定，能在非厌氧条件下的几乎所有细胞中表达，这种稳定性极大地拓宽了荧光蛋白的应用范围。迄今为止，各种 BiFC 系统已经被成功用于不同宿主细胞中，包括动物，植物、真菌和细菌中；除了体内，BiFC技术还能应用于体外试验中2。

荧光蛋白片段种类多在众多的蛋白片段互补技术中，双分子荧光互补技术中可选择的互补蛋白片段更多，主要体现在如下 3 方面。

①荧光蛋白自身种类多，绿色荧光蛋白通过突变，可以形成激发波长不一样的荧光蛋白，如 YFP，BFP，CFP 和 RFP等2。

②同一种荧光蛋白可以在不同位置剪切成能进行功能互补的荧光片段2。

③不同的荧光片段之间可以进行功能互补。互补的荧光片段种类多，使得通过荧光互补技术在同一细胞中观察多个蛋白的相互作用成为可能2。

BiFC 系统对温度敏感BiFC 技术的最大缺陷是多个 BiFC 系统对温度敏感。温度高时，片段间不易互补形成完整的荧光蛋白。一般在30 ℃以下形成互补效应好，温度越低，越有利于片段之间的互补，这就对研究细胞在生理条件下的蛋白质相互作用带来不利因素2。

BiFC 复合物的形成过程可逆这种特点使得通过 BiFC 技术来研究蛋白相互作用的动态变化成为可能2。

通过定点突变可有效减少假阳性结果的出现实验中，一些阴性对照的信号在检测蛋白与蛋白相互作用中较高，这将造成假阳性结果。可能的原因是最初分开的 2 个无荧光的片段具有内在的亲和力，导致无特定相互作用的自发组装。由于这个局限，BiFC 的高灵敏度、时空分辨率和准确性受到质疑。研究表明通过定点缺失和定点突变改变蛋白相互作用可有效减少假阳性结果的出现2。

应用研究蛋白之间的相互作用这是 BiFC 的一个主要应用，通过 BiFC，已经很直观地观察到了多个蛋白之间存在相互作用2。

蛋白相互作用的定位研究不同的蛋白位于细胞的不同位置，为了研究蛋白的功能与结构，首先要了解它们之间的相互作用。BiFC 技术能确定蛋白相互作用的准确位置。并且能够检测相互作用的蛋白稳定性。BiFC 不仅能观测到细胞内较强相互作用，也能检测到比较弱的相互作用2。

蛋白质构型的研究BiFC 系统还被用于蛋白质构象研究。Lim 等人利用双分子荧光互补技术，研究分析了 Wiskott-Aldrich 综合症相关蛋白 (Wiskott-Aldrich syndrome protein，WASP) 的构象变化。他们将 YFP 的两个片段与 WASP 构建成了一个融合基因形式:YFP1-154-WASP-YFP155-238。将这个融合基因导入酿酒酵母，在细胞核中能检测到强烈的荧光。而共表达 YFP1-154-WASP 和 WASP-YFP155-238 的酵母却检测不到荧光。这就表明，WASP 存在分子内的相互作用，进一步的试验表明，WASP 在细胞中是一种自我封闭的构象存在2。

用于检测RNABiFC 对细胞内的 RNA 可进行特异性标记2。

影响因素在 BiFC 实验中影响因素有很多，除了宿主细胞和荧光蛋白的种类外，还有形成融合蛋白时插入到荧光蛋白片段上的小肽和荧光蛋白的位置2。

1.Linker 的序列

通常在荧光蛋白质片段与目标蛋白质之间加 1 个连接肽，防止由于蛋白质空间位阻导致蛋白片段间不能相互靠近现象出现。常用的连接肽氨基酸序列有RSIAT、RPACK-IPNDLKQKVMNH和GGGGS等。linker 为单链结构，因此存在空间位置上的旋转灵活性，这使荧光蛋白片段更容易相互靠近发生相互作用，重新产生荧光2。

2.荧光蛋白片段的位置

在 BiFC 试验中，荧光蛋白片段的位置对结果的影响是显著的2。

本词条内容贡献者为:

成玉林 - 副教授 - 重庆大学