[科普中国]-巨噬细胞

巨噬细胞（英语：Macrophages，缩写为mø）是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫（先天性免疫）和特异性防卫（细胞免疫）。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用（即吞噬以及消化），并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

简介巨噬细胞(macrophage cell)也称组织细胞( histocyte)，是由血液中的单核细胞穿出血管后分化而成的。单核细胞进入结缔组织后，体积增大，内质网和线粒体增生，溶酶体增多，吞噬功能增强。巨噬细胞的寿命因所在组织器官而异，一般可存活数月或更长。

单核细胞向巨噬细胞分化的过程中还伴随某些表型的改变，包括：

①细胞表面受体如补体iC3b和转铁蛋白的受体表达增加；

②细胞内酶如α-氨基己糖苷酯酶(α- amino glycoside esterase)、肌酸激酶、组织谷氨酰胺转移酶( tissue transglutaminase)和cAM依赖的蛋白激酶表达增强；

③分泌过氧化氢和超氧离子的能力降低。同时，此过程还明显受IFN-γ和激素的负调节1。

形态巨噬细胞分布广泛，在疏松结缔组织内数量较多。巨噬细胞形态多样，因其功能状态不同而变化，一般为圆形或椭圆形，并有短小突起，功能活跃者常伸出较长伪足而呈不规则形。胞核较小，呈圆形或椭圆形，着色较深。扫描电镜下，细胞表面有许多微皱褶和突起，呈彩球状。透射电镜下，胞质含有大量初级溶酶体、次级溶酶体、吞噬小泡和吞噬小体，此外还有较发达的高尔基复合体、少量线粒体和粗面内质网等。巨噬细胞在体外培养时可附着在玻璃和塑料表面，其胞质非特异性脂酶阳性，常以此收集和鉴别巨噬细胞1。

作用除去颗粒球和淋巴球，剩下的大约5%是巨噬细胞。巨噬细胞是形似变形虫的细胞，吞食并处理大型异物、细胞排泄出的老旧废物、寿终的红细胞等，还奔赴发生炎症的部位处理异物，是一种守护范围很广的白血球。

巨噬细胞不仅存在于血液中，还分布全身。根据所处的位置不同，名字和形状也各不相同。单核细胞随血液循环至全身，奔向炎症部位。肺巨噬细胞在肺部活动，肝巨噬细胞在肝脏中活动，神经胶质细胞则在脑部活动。

单细胞生物时代的防御系统相当单纯，巨噬细胞吞噬异物，使它成为垃圾排泄到体外。但是，当身体不断地遭受到病毒和异种蛋白质(自身不应有的蛋白质)的威胁时，依靠这种程度的防御系统就无法生存了。于是生物向脊椎动物进化时，形成了新的防御系统。

像病毒那样微小的异物，比起吞噬，黏着攻击的效果更好。因此，放弃巨噬细胞的吞噬能力、以生产抗体纠缠敌方的功能为主的淋巴球登场了；而将巨噬细胞的吞噬能力进一步强化的则是颗粒球2。

生命周期当单核细胞经血管的内皮细胞层进入一已受损的组织时（这过程被称为白血球外渗作用），它经过一连串转变以成为巨噬细胞。单核细胞会因化学趋向性而被化学物质的刺激吸引至受损处，这些刺激包括受伤细胞、病原体、由肥大细胞和嗜碱性细胞所释放的组织胺，以及由已于该处的巨噬细胞释出的细胞因子。在某些地方，如睾丸，巨噬细胞已被证实会透过增殖以移殖于此。

与寿命较短的中性粒细胞不同，其寿命可达数个月至数年不等。[2]

培养方法巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW264.7等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：

1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。

2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。

3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。

7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。

8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。

9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃，5%CO2温箱中培养。

培养环境细胞培养是无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁，空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。

常用设施及设备

1、超净工作台：也称净化工作台，侧流式，直流式和外流式三大类。

2、无菌操作间：一般由衣间，缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱，离心机，倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱，冷藏器及消毒好的无菌物品等。

3、操作间：普通培养箱，离心机，水浴锅，定时钟，普通天平及日常分析处理物

4、洗刷消毒间：烤箱，消毒锅，蒸馏水处理器及酸缸等。

5、分析间：显微镜，计算机及打印等。

培养器皿

常用细胞培养器皿有培养瓶，培养板，培养皿等。常准备量是使用量的三倍。器皿应选择透明度好，无毒，利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。

1、液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液，血清等液体，常用规格有500ml，250ml，100ml等几种。

2、培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml，100ml，50ml，25ml，10ml等几种。

3、培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm，60mm，120mm等几种。

4、吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml和10ml两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。

5、离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml，30ml，15ml；后者则多为10ml和5ml。

6、其它：如三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，注射器等。

细胞培养温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。

培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，但细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。

相反，温度不低于0℃时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用;把细胞放入25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在4℃数小时后，再回到37℃培养，细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲亚砜或甘油)，可在深低温下如-80℃或-196℃(液氮)长期保存。

合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长，如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6。每种细胞都有其最适pH值。

分离方法腹腔中分离

1、取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4%淀粉肉汤。3～4天以后收集腹腔细胞。

2、如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从一步开始。放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10%小牛血清的PBS）。轻轻按摩腹部5分钟。

3、以下均无菌操作。剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g10分钟，去上清液。

4、用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g10分钟，去上清液。用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

巨噬细胞的分离和纯化

1、取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

2、分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3、分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过00目的钢丝网，分离单细胞。

4、以下过程均在4℃中进行。分别处移动图片理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g10分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入10ml低渗液（20mmol/LTris，0.75%氯化铵，pH7.4），37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1%和10%。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。

5、离心200×g10分钟，去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液（比重1.077）上，离心400×g20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。

6、用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90%以上，巨噬细胞占全部细胞的90%以上。

抑制因子巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是集细胞因子、生长因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子。MIF高度保守，在多种急慢性炎症性疾病中发挥多种免疫功能。

MIF参与动脉粥样硬化发病和发展，即斑块形成、动脉损伤后重建、动脉瘤形成、心肌梗死、缺血再灌注损伤等机制。此外，其他形式的心肌功能不全和炎症与MIF参与血管再生有关。从特征和功能方面，MIF显著不同于其他细胞因子，是提高动脉粥样硬化治疗的最主要的靶向。

利用MIF，作为心血管疾病治疗靶向和诊断标志物。第四军医大学西京医院呼吸内科、西安市中心医院和陕西省绥德县医院的研究人员共同完成的研究发现，白藜芦醇可以抑制肺泡巨噬细胞过度释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6），为慢性气道炎症的治疗带来了新的希望。

在呼吸系统疾病中，气道炎症的慢性化以及气道的重塑是多种肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等的共同病理生理特征，该特征是由多种炎症细胞及细胞因子相互作用所致的气道病变。在病理生理过程中巨噬细胞起着极为重要的作用，巨噬细胞在细菌产物、烟雾等有害成分如甲醛、NO2及其他一些氧化产物刺激下，向肺组织迁移并释放多种细胞因子如TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1等，反过来这些细胞因子又可趋化中性粒细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞等向肺组织迁移，这些细胞和炎性细胞因子是引起气道炎症慢性化和气道严重损伤的重要因素。如果能有效地抑制细胞和炎症细胞因子的释放，就会降低及减轻气道的损伤。为探讨白藜芦醇（Res）对小鼠肺泡巨噬细胞释放细胞因子IL-6、TNF-α的影响，研究人员经从小鼠支气管肺泡灌洗中获得肺泡巨噬细胞，分5组进行培养，各组在培养4、6、12、24小时提取上清液，应用ELISA法测定上清液中IL-6、TNF-α含量。

在LPS刺激下IL-6于12小时达释放高峰，在高峰期随着白藜芦醇浓度的逐步加大，IL-6的含量相应逐渐降低，E组IL-6含量明显低于只有内毒素刺激的A组（P