生物节律紊乱克隆猴如何促进脑神经研究

作者：中科院上海植物生理生态研究所 博士后 谭艳秋

2019年1月24日，中国科学院神经科学研究所的生物节律与衰老疾病研究组和非人灵长类研究平台的科学家们利用CRISPR/Cas基因编辑方法，敲除了体外受精猴胚胎中的生物节律核心基因-BMAL1，在国际上首次获得了生物节律紊乱克隆猴。该成果相关的系列论文发表于当日的《国家科学评论》上，张洪钧研究员、孙强研究员和刘真研究员合作领导了该研究。

生物节律紊乱克隆猴的成功获得，将为人类研究多种精神疾病提供便利的实验模型，是我国继去年获得世界首例体细胞核移植克隆猴“中中”、“华华”后，我国生命科学领域的又一标志性事件。

我们为什么要建立生物节律紊乱克隆猴模型？

生物节律与身体健康息息相关。现代社会，来自方方面面的压力使人类的作息时间很难严格遵循于体内的生物钟。加班、轮班，频繁地跨越时区，熬夜玩手机等等，这些不良的生活习惯往往会干扰人体内生物钟，对人的精神状态、新陈代谢、睡眠周期和身体抵抗力等造成负面影响。此前，科学家们已经发现，人的生物节律紊乱与多种睡眠障碍、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、精神类疾病（如抑郁症）、糖尿病、肿瘤、以及心血管等疾病密切相关。

以往，科学家们主要利用小鼠和果蝇作为动物研究的主要模型。但在研究生物节律方面，小鼠是夜行动物，与人类的生物节律存在本质差别；而果蝇则几乎无法重现在人类中观察到的失眠、抑郁等复杂行为。因此，传统的模式生物研究极大地制约了生物节律紊乱机理研究和相关疾病治疗手段的研发，而非人灵长类动物与人类最接近，是研究节律紊乱相关疾病机理和诊治手段比较理想的动物模型，因此建立非人灵长类生物节律紊乱模型迫在眉睫。

为了实现获得该克隆猴模型，我国科学家利用了怎样的先进技术？

中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）和上海脑科学与类脑研究中心研究团队具体实施了该项目的研究。此前，科学家们已经发现，在人类等哺乳动物的下丘脑中有一个控制生物节律的“起搏器”，学名叫视交叉上核。视交叉上核可以根据自然界光-暗周期调控生理和活动节律，并能通过激素和神经信号调节生物钟。而BMAL1基因是参与调控这个“起搏器”的主要基因之一。

经过两年多的努力，中心首次利用CRISPR/Cas基因编辑方法，敲除了体外受精的猴胚胎中的生物节律核心基因-BMAL1，产生了一批BMAL1缺失的猕猴。在行为学方面，这些食蟹猴具有与人类相似的昼夜活动紊乱、睡眠障碍、焦虑和精神分裂症等症状；病理分析方面，这些食蟹猴体内导致炎症、睡眠障碍、抑郁等相关的基因表达量上升，为模拟人的节律紊乱相关疾病迈出了关键的一步。

在此基础上，中心研究团队采集了其中一只BMAL1缺失的猕猴体细胞，运用体细胞克隆技术，最终获得了五只BMAL1基因敲除的克隆猴，这是国际上首次成功构建一批遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型。

如何证明我们获得的疾病克隆猴模型是有效的？

为了证明基因敲除后的个体确实出现了节律紊乱症状，小猴断奶半年后，研究人员就从多个方面开始观察其生物节律。通过猴子们身上佩戴的传感器，可以随时监测到它们的昼夜活动情况。

结果发现敲除猴并未按照24小时的周期活动，在夜间活动明显增多，这它们可能出现了失眠问题。研究人员还通过手术在猴子体内植入侵入型传感器，分析其睡眠周期。结果显示，敲除猴的快速眼动睡眠（REM，浅睡期）和慢波睡眠（NREM，熟睡期）明显减少。此外，科学家们还发现帮助睡眠的褪黑素在敲除猴中分泌较少。基因表达谱分析也证实，敲除猴的大多数节律基因表达异常。以上证据充分说明了中国科学家成功获得了节律紊乱克隆猴模型。那么，这些小猴身上都有哪些精神疾病相关的症状呢？

节律紊乱以及睡眠障碍常常是抑郁症、自闭症等多种精神疾病发病的早期症状。之前我们很难认定一只小鼠有精神方面的问题，通过小鼠行为判断其精神异常缺乏定量化依据，甚至在定性观察方面都一直没有取得太大进展。而在灵长类身上，精神问题的表观症状及生物学指标就很明显了。

例如，研究人员在血液检测中发现与压力应激相关的皮质醇在敲除猴的血液中一直处于高水平，这让他们联想到敲除猴在与人接触时极度紧张的反应。当有人靠近敲除猴时，它会双手抱住头部，蜷缩在角落里，不敢活动。如果将敲除猴放入一个新环境中，它也不能很快地适应，不敢像正常猴那样在环境中自由探索。

此外研究人员给猴子们做了一个经典的听觉刺激实验，在给出的一连串规律的声音中随机插入特殊的声音，记录猴子听到声音时的脑电图像。结果发现敲除猴的大脑在识别和反应这些特殊事件的能力上不如正常猴，表现出于与精神分裂患者类似的症状。

相比“中中”和“华华”，这项研究取得了哪些新进展？

在此之前，“中中”和“华华”所使用的细胞都来自野生型的猕猴，但此次科学家们首次使用经过基因编辑的猕猴作为体细胞供体，科研价值和研究意义更为巨大。再者，克隆“中中”、“华华”所用到的体细胞提取自刚刚流产的猴子胚胎（即未出生的小猴），其实并不算是猕猴个体的体细胞。最后，上次实验的成功率尚不足1%，因此导致克隆猴成本高昂，很可能因为成本问题而让这项技术长期停留在纸面上。

在这次工作之前，孙强等专家已经通过直接向猴受精卵中注射CRISPR/Cas9的方法获得了不太完美的BMAL1敲除食蟹猴，之所以说不完美，是由于这些基因敲除猴属于“嵌合体”，体内不同细胞的基因型有差异，因此在最严谨的定义上说还不算是能充分说明问题的动物模型。

而这次，中国科学院神经科学研究所的孙强研究员与刘真研究员、张洪钧研究员合作，利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9），成功构建了世界首例核心节律基因BMAL1敲除食蟹猴模型。使科学家们批量对基因编辑的猴子进行克隆并用于科学研究从此成为可能。

这项研究中获得的非人灵长类节律紊乱模型有望给节律研究带来新的突破，我国在非人灵长类模型制备技术上的领先将转化为整体基础科研，尤其是神经科学研究走向世界前列的历史机遇。

该成果表明中国正式开启了批量化、标准化创建疾病克隆猴模型的新时代，有望为脑认知功能研究、重大疾病早期诊断与干预、药物研发等提供新型高效的动物模型。

此外，该成果的应用有助于缩短药物研发周期，提高药物研发成功率，必将极大地促进生命科学和医学的发展，加快我国新药创制与研发的进程。