基因编辑

简介

基因编辑（Gene Editing）是指通过基因编辑技术对生物体基因组特定目标进行修饰的过程。高效而精准的实现基因插入、缺失或替换，从而改变其遗传信息和表现型特征。

基因编辑技术是一种革命性的生物技术，用于修改生物体的基因组。它基于多种工具，使科学家能够针对特定的基因序列进行精确的编辑和改变。

基因编辑过程：在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂（DSB），通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来修复DSB，同时完成基因编辑。

基因编辑技术具有巨大的潜力，可以在医学、农业和其他领域产生革命性的影响。然而，这项技术需要仔细权衡伦理和安全，并加强监管措施，以确保其安全性和可持续性。

技术原理

同源重组技术（homologous recombination，HR）是较早使用的基因编辑技术，其原理是将外源性目的基因导入受体细胞，通过同源序列交换，使外源性DNA片段取代原位点上的基因，从而达到使特定基因失活或修复缺陷基因的目的。由于效率极低，且出错率高，因此其应用受到了一定的限制。

20世纪80年代末、90年代初，人们发现通过在特定的基因组靶点诱导双链断裂(double-stranded break，DSB)能在染色体水平上实现高效和准确的基因修饰。

DSB被诱导后，细胞内将启动两种主要的修复机制：非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重组（homology directed repair，HDR）。NHEJ不依赖模板直接连接DNA两端，可以在DSB位点有效产生不同长度片段的插入或缺失，通常导致基因功能失活，快速但不精确；HDR依赖于模板进行定向修复，可以实现特定位点的精确插入、缺失或者碱基置换，更精确。

此后，科学家便专注于开发各种基于核酸内切酶机制的基因编辑技术，以实现对特定基因组位点DSB的精确诱导。

技术锌指核酸酶技术（ZFN）

技术锌指核酸酶技术（ZFN）。

**背景：**1984年，科学家在非洲爪蟾的转录因子中发现锌指蛋白，经过人工改造并与核酸内切酶连接，发展成锌指核酸酶技术（Zinc Finger Nuclease, ZFN）。

**结构：**锌指核酸酶由两个部分组成：锌指蛋白（Zinc Finger Protein, ZFP）和Fok1核酸内切酶。锌指蛋白是由多个锌指结构串联而成，用于识别和结合特定的基因序列。Fok1核酸内切酶具有特异性的切割能力，通过二聚化形成一个有效的切割复合物，可以切割真核基因组中的任何特定识别序列。锌指蛋白中的DNA识别域由一系列Cys2-His2锌指结构组成（通常为3-4个），每个锌指结构识别并结合特定的三个碱基。

**工作原理：**多个锌指蛋白结构串联形成一个锌指蛋白组，能够识别特定的碱基序列，具有高度的特异性。非特异性核酸内切酶来自Fok1，它位于C端，由96个氨基酸残基组成切割域。Fok1是一种来自海床黄杆菌的限制性内切酶，只有在二聚体状态下才具有切割活性。每个Fok1单体与一个锌指蛋白组相连形成一个ZFN，它们识别特定的位点，当两个识别位点之间的距离适当（6-8个碱基）时，两个ZFN单体相互作用形成切割功能，实现DNA的定点切割。

**优势：**能够在指定的位点引发DNA双链断裂，促使细胞启动自然的DNA修复过程，包括同源重组和非同源末端连接，从而诱导位点特异性的基因重组。相对于传统方法，锌指核酸酶技术提高了基因组定点修饰的效率3-5个数量级，并有极高的特异性。可以在5-8周内实现永久、可遗传的基因删除、插入和修饰。

局限性：（1）锌指核酸酶存在上下文依赖效应，即锌指蛋白之间的相互作用可能影响对特定核苷酸序列的识别和结合。（2）在人类基因组中，每隔至少500个碱基才能结合一个ZFN靶点，由模块组装的ZFN不能直接切割染色体。

转录激活样效应因子核酸酶技术

转录激活样效应因子核酸酶技术（TALEN）。

**背景：**2007年，在植物黄单胞菌（Xanthomonas）中发现一种特殊的分泌蛋白质，被称为转录激活因子样效应物（Transcription activator-Like effector, TALE）。这种蛋白质具有结合植物宿主基因组并激活转录的能力。2009年，TALE与DNA结合的机制被阐明。2012年，转录激活因子样效应物技术出现，逐渐取代了锌指核酸酶技术。

结构及工作原理：TALEN由两个部分组成：特异性识别和结合DNA的区域，即TALE；与ZFN相同的IIＳ型Fok1核酸酶，通过二聚化作用使目标DNA片段发生双链断裂。然后，利用细胞内的修复机制修复损伤。

局限性：（1）最初TALEN蛋白只能识别“胸腺嘧啶”。（2）在TALEN上连接重组酶或位点特异性转座酶，可自动完成对基因组的切割和连接，可以在任何细胞中使用（即使在没有NHEJ和HDR修复通路的细胞中），扩大了TALEN的应用范围。然而，这些酶会产生较为明显的脱靶效应。

转录激活样效应因子核酸酶工作原理图：TALEN由N端转运信号、Ｃ端核定位信号、转录激活结构域和 DNA特异性识别结合结构域组成。

成簇规律间隔短回文重复序列-相关核酸酶

成簇规律间隔短回文重复序列-相关核酸酶技术（CRISPR-Cas）。

背景：CRISPR-Cas系统（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein）由两部分构成：，即成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）及相关蛋白（Cas）。CRISPR序列由高度保守的重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）组成。其中，间隔序列来源于外源基因。CRISPR序列附近还有一些相关基因，编码一系列Cas蛋白（核酸酶）。该系统最初是从细菌和古细菌中发现的一种适应性免疫系统，可以抵御病毒和质粒DNA的入侵。它的工作过程分为三个阶段：（1）获取；根据外源基因的原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motifs，PAM）确定原间隔序列，Cas蛋白将其切割，整合到CRISPR序列中。（2）表达：间隔序列经过转录、加工成为成熟的crRNA，识别外源基因。（3）干扰：crRNA与特异性Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，特异性切割外源基因。

**结构及工作原理：**CRISPR-Cas9包含两种重要组分：行使核酸内切酶功能的Cas9蛋白；具有导向功能的sgRNA（由tracrRNA和crRNA连接而成）。Cas9由1409个氨基酸组成，包含两个关键的核酸酶结构域（RuvC和HNH）。HNH结构域负责切割与其互补的DNA单链，切割位点位于PAM（protospacer adjacent motifs）序列上游3个核苷酸处。RuvC结构域则负责切割另一条DNA链，切割位点位于PAM序列上游3-8个核苷酸处。

局限性：（1）对PAM序列的依赖性和脱靶效应。（2）存在嵌合体现象。

技术应用

遗传疾病治疗

基因编辑可以用于修复或纠正导致遗传疾病的突变基因。例如，可以使用CRISPR-Cas9系统来修复单基因疾病（如囊性纤维化、遗传性失聪等）中的突变基因，恢复其正常功能。

癌症治疗

基因编辑可用于研究和治疗癌症。例如，科学家可以利用基因编辑技术来研究肿瘤抑制基因和肿瘤促进基因，以了解其对癌症发展的影响，并开发新的治疗方法。

农作物改良

基因编辑可以用于改良农作物，提高其产量、耐病性和适应性。通过编辑农作物基因组中的关键基因，可以使其具备更好的抗虫性、耐旱性、耐盐性等特性。

遗传调控研究

基因编辑可用于研究基因在生物体发育和功能中的作用。通过删除、插入或改变特定基因的序列，科学家可以研究基因对个体发育、生理过程和疾病发展的影响。

生物学研究工具：基因编辑技术提供了研究生物学基本原理的有力工具。通过编辑模型生物（如小鼠、果蝇、线虫等）的基因，科学家可以研究基因功能、信号传导途径和疾病机制等。

生物能源生产

基因编辑可以用于改良微生物，使其能够更有效地产生生物燃料或其他有用的化合物。

技术突破

（1）2016年，研发的碱基编辑器base editor（BE）是一种可以在不产生DNA双链断裂的情况下实现单碱基水平碱基替换的工具，其在基础研究和基因治疗领域显示出了极大的潜力。碱基编辑器主要有3种类型：胞嘧啶碱基编辑器 cytosine base editor（CBE）、腺嘌呤碱基编辑器adenine base editor（ABE）和糖基化酶碱基编辑器glycosylase base editor（GBE），它们在不需要DNA双链断裂和编辑模板的情况下可分别实现C-to-T，A-to-G和C-to-G的碱基编辑。

（2）2019年，据英国《自然》杂志21日发表的一项研究，美国博德研究所核心成员、华人生物学家刘如谦及其同事，提出一项新型编辑技术——“先导编辑Prime Editor（PE）”，支持靶向点突变、精准插入、精准删除及其各种组合，而不造成DNA双链断裂。报告称，这项技术比传统Cas9编辑技术效率更高，副产物更少，脱靶率更低。

（3）2021年，美国博德研究所的研究人员开发了一种新版本的先导编辑：双先导编辑（twin prime editing, twinPE），它可以整入或置換出基因大小的DNA序列。3

（4）2022年，中国科学院赖良学课题组将腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和糖苷酶碱基编辑器（CGBE）结合，开发出新型的双碱基编辑器——AGBE。它可以利用单个向导RNA（sgRNA）诱导同一等位基因的靶序列单独或同时发生包括A-to-G、C-to-G、C-to-T和C-to-A等4种不同类型的碱基转换。4

未来发展

未来的优化方向：提高编辑效率、降低脱靶风险（增强靶向性/特异性）、降低对细胞的扰动、优化递送方式（提高治疗效率）。

风险和争议

（1）在技术层面，基因编辑技术的伦理问题在于技术上尚不完善，可能导致应用过程中的诸多不确定性。

①准确率不足导致的“脱靶效应”5

脱靶效应是指，基因编辑工具在编辑目标基因时，无法精确到只和靶序列结合，切割操作并不精准，依靠外源DNA做同源修复效率低，可能会误切或者误编辑到非目标区域，从而导致非预期的基因编辑。

②编辑效率低下产生的“嵌合效应”6

由于胚胎细胞的特殊性质，基因编辑技术在编辑人类胚胎时，可能会导致未完全编辑细胞的“嵌合效应”。嵌合体：不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体，亦指染色体异常类型之一。

③CRISPR/Cas9系统进入人体内导致的“免疫效应”7

④编辑特定功能性基因导致的不可预知的“副作用”8

（2）在社会层面，基因编辑技术可能会对社会公平与正义产生冲击，导致社会发展伦理问题的出现。例如，基因编辑手段可能加剧社会中存在的偏见和狭隘，加剧家庭观念及共同利益的冲击，动摇技术的平等获取和社会正义。

（3）在生态层面，基因编辑技术可以改变物种的基因库，带来不可控的风险后果。例如，基因编辑所带来的“多代效应”后果难以评估，可能会人为增加人类出现遗传问题的风险；在农业领域的应用可能会对生态环境产生不良影响，损害整体的自然生态，人为定向基因选择可能会导致基因的多样性消失；基因编辑食品所涉及的食品安全和监管，以及间接引发的法律规制等问题。9

典型事件

2018年11月26日，南方科技大学副教授贺建奎在香港举行的国际基因组编辑峰会上宣布，他已经使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功地将一对名为“露露”和“娜娜”双胞胎女婴的CCR5基因进行了改造，于中国诞使其具有抗HIV的能力。第一对基因编辑婴儿在中国诞生，这一事件引起了全球范围内的广泛关注和争议。

2022年10月，一位名叫Terry Horgan的27岁杜氏肌营养不良症（duchenne muscular dystrophy，DMD）患者在接受腺相关病毒（AAV9）载体递送的CRISPR基因编辑治疗后不幸去世。虽然目前尚不清楚Terry Horgan去世的真正原因，以及是否与CRISPR有关，但它的去世无疑引发了人们对CRISPR基因编辑疗法前景的担忧和质疑。

法律规定

2020年12月26日，第十三届全国人民代表大会常务委员会第二十四次会议通过《中华人民共和国刑法修正案（十一）》，在刑法第三百三十六条后增加一条，作为第三百三十六条之一：“将基因编辑、克隆的人类胚胎植入人体或者动物体内，或者将基因编辑、克隆的动物胚胎植入人体内，情节严重的，处三年以下有期徒刑或者拘役，并处罚金；情节特别严重的，处三年以上七年以下有期徒刑，并处罚金”。

2021年2月22日，最高人民法院审判委员会第1832次会议、2021年2月26日最高人民检察院第十三届检察委员会第六十三次会议通过的《最高人民法院最高人民检察院关于执行，<中华人民共和国刑法>确定罪名的补充规定（七）》规定了非法植入基因编辑、克隆胚胎罪罪名。

2021年7月12日，世界卫生组织发布两份互相关联的报告《人类基因编辑管治框架》与《人类基因编辑建议》，就如何在全球范围内使人类基因编辑技术成为促进公共健康的工具提出了首份建议，重点强调安全、有效及合乎道德。报告在九大不同领域分别对人类基因编辑的管理和监督提出了建议，包括人类基因编辑登记注册；国际研究以及出于医疗目的的跨国旅行；非法、未注册、不道德和不安全的研究；知识产权；以及教育、参与和赋权等。