这条捷径，就是“草根”微生物的巨星之路丨微生物“智”造

作者：李辉、吕雪峰（中国科学院青岛生物能源与过程研究所 微生物制造工程中心）

文章来源于科学大院公众号（ID：kexuedayuan）

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人类世界的每个行业里都存在“巨星”，微生物的世界里也不例外。但如同很少人一开始就具备巨星的特质一样，微生物世界里也少有一开始就能满足工程师所有期待的微生物，更多的是有一技之长，却并不全能的“草根选手”。这样的“草根”微生物，有快速成为“巨星”的可能吗？

工业微生物界给出的答案是：yes！

慧眼识珠的工程师和快速补齐“草根”微生物短板的技术是关键。今天，大院要介绍的就是一种能够让“草根”微生物快速进阶的技术——无细胞基因表达系统（Cell-free gene expression system）。

“草根”成名的必经之路

在了解具体的技术之前，我们需要先来回答三个问题。

“明星”微生物是什么样？

作为工业微生物界的明星，必须拥有出色的三个核心指标：产物的滴度（Titer）、产率（Yield）和生产效率（Productivity），这三个参数的详解见上一期生物工程师的致富之路：微生物细胞工厂打造指南。其次它的食谱应尽可能地广泛，在恶劣环境中的耐受性也要出众。而为了达成这些指标，要求工程师拥有较为完善的工具包，以便对这种微生物进行改造。

“明星”微生物：大肠杆菌（左）和酿酒酵母（右）

（左图来源：veer；右图来源：维基百科）

如何才能获得工程师的青睐？

各方面都平庸的“草根”微生物是不会有任何机会的。能获得青睐的选手必须是可塑之材，至少在与工业应用相关的性状方面它要远远强于一般的微生物。比如，对于一个生产乙醇的微生物细胞工厂来说，能够同时利用葡萄糖和木糖（底物范围广）或者能在高浓度的乙醇中活得很滋润（产物耐受性好）都是很加分的性状。

“草根”变“巨星”需要逾越哪些鸿沟？

一般而言，在一个微生物成为高效生产化学品的细胞工厂之前都需要被工程师进行大量的改造，直到找出生产化学品的最优解。对于“明星”微生物来说，工程师对它们的改造手段比较成熟，在它们中进行大量试错也较为方便。但是对于“草根”微生物而言，专门为它们量身定做的改造技术较为欠缺，改造起来费时费力，而进行大量试错对工程师来说更是雪上加霜。因此，对“草根”微生物改造能力的不成熟是制约它们快速崛起的一个主要问题。

解决这个问题通常有两种策略：第一种策略是从头开始逐步去开发和完善改造“草根”微生物所需的工具包，但代价是漫长的时间。第二种策略则是尝试规避试错的障碍，直接为微生物的改造提供一个理想的改造方案，这样即使改造起来不方便，但由于改造的地方不多，时间成本也在可接受的范围之内。

第二种“造星”策略成功实现的关键在于必须要在较短的时间内提供一个理想的改造方案，而无细胞基因表达系统正是能实现这种可能性的一种技术。

巨星修炼场：无细胞基因表达系统

理想的方案是什么呢？具体而言，是微生物细胞内一条将原料高效转化成目标化合物的代谢途径。代谢途径的高效体现在两个方面：首先，功能上选出来的酶要能把原料逐步转化成目标化合物。其次，不同酶之间的相对量要保持协调，任何一个酶的效率都不能掉链子。

无细胞基因表达系统是指能够将DNA转化为有功能的RNA或者蛋白质的任何方法，不需要使用完整有生命的细胞就能激活复杂的生物学过程。简单来讲，无细胞基因表达系统就是把细胞内的一部分功能在体外进行重现。

那它究竟是如何在较短的时间内为工程师提供一个理想的改造方案？这里有一个很贴切的例子。

丁醇是工业上一种重要的溶剂和燃料，其全球市场高达50亿美元/每年。而有一种产乙酸的梭菌（Clostridium autoethanogenum : C.autoethanogenum，下文所提的梭菌均特指这一种），它的底物范围很广，既能利用复杂的糖类（比如纤维素）也能利用一些简单的化合物（比如CO2/H2和CO），工业性状良好，能在商业化的规模中生产乙醇。但它不能产丁醇，遗传改造工具也不够成熟。

美国西北大学的生物工程师们希望将这种“草根”微生物打造成一个能够生产丁醇的微生物细胞工厂。要想让梭菌产丁醇，需要在它体内搭建一个新的代谢途径，即从已有代谢产物乙酰辅酶A到丁醇的代谢途径，这个途径需要六步反应，由5种不同功能的酶来实现。

自然界中能完成同一个反应的酶往往有很多种，但具体哪个最好只有试了才知道。如果前四步每个酶都选择6个同源的蛋白，每个酶再设置3个不同的浓度梯度，那么最终的组合方式将有314928种可能。

从乙酰辅酶A到丁醇的代谢途径以及催化相应反应的酶（Ashty S. Karim et al., 2020）

在梭菌中组装一个代谢途径一般需要数周甚至数月的时间，而尝试30万种可能的途径对工程师来说明显超纲了。为了破解这道超纲的问题，他们针对梭菌开发了一种基于无细胞表达系统，一个能快速找到理想改造方案的技术平台：体外原型化和快速优化生物合成酶的平台（iPROBE: In vitro prototyping and rapid optimization of biosynthetic enzymes ）。

利用这个平台来组装同样的代谢途径有两种策略，而它们都能把组装时间缩短到以天计算。

第一种策略是分别将每种候选的酶在大肠杆菌中过量生产，确保大肠杆菌中候选酶的量很高，再将细胞裂解，然后直接将不同的裂解液进行混合，混合的裂解液中就包含了在逻辑上组装好的途径，同时可以通过裂解液的添加量来控制不同酶之间的比值。之后再将底物添加到混合的裂解液中，最终通过分析仪器来检测是否含有目标产物及其含量的高低。

第二种策略和第一种策略的不同之处在于，在候选酶的生产过程中它是利用连有候选酶编码基因的质粒加上细胞裂解液，裂解液中所含有的转录和翻译机器可以将质粒中的候选基因转录翻译成候选的酶，产生酶量的多少可以通过质粒的添加量来控制。代谢途径的组装和产物后续的检测两种策略是一致的。

利用cell-free系统同时对多种组合的途径进行测试(Ashty S. Karim et al., 2020)

降低途径的组装时间是无细胞系统最为突出的优点之一。另外，使用细胞裂解液来组装代谢途径，其中涉及的操作以及对反应体系的检测都能让相应的机器去做，大大降低了人力投入，让生物工程师拥有了对大量不同组合代谢途径进行分析比较的可能性。

生物工程师最终要做的就是选择在体外表现最好的代谢途径，把编码相应酶的基因放到“草根”微生物的基因组上，通过使用不同强度的启动子来控制它们在细胞中存在的量，以此来复制在体外找到的最佳改造方案。在上述案例中，当生物工程师把找到的最优解应用到梭菌后，它产丁醇的滴度变成了22±0.1mM，而之前所报道的在梭菌中产丁醇的滴度最高只有2mM左右，丁醇的滴度整整提高了10倍之多。

西北大学的生物工程师们开发出这个基于无细胞基因表达系统的平台后，他们还尝试利用它找到梭菌生产3-羟基丁酸（3-HB）的最佳改造方案（3-HB是一种高值的专用化学品）。即使梭菌原本并不能产3-HB,但当他们将找到最佳改造策略并应用到梭菌中后，3-HB微生物细胞工厂生产3-HB的滴度能够达到15g/L，生产效率也能>1.5g L-1h-1 。

这些数据不仅在梭菌中创了记录，也破了之前由工业微生物界的“明星”大肠杆菌和酿酒酵母所创造的记录，梭菌细胞工厂也实现了华丽的转身，成为名副其实的“巨星”。

不会偷懒的生物工程师不是好的工程师

在寻找梭菌产丁醇的最佳改造方案时，即使在有限的条件之内，代谢途径的种类也已达到30多万种。尽管无细胞表达系统为海量的途径分析提供了可能性，但是工程师们并没有逐一验证这30多万种途径的差别，毕竟不会偷懒的生物工程师不是好的工程师。

但他们也的确对30多万种可能的途径都做了评估，只不过直接通过实验评估的只有120种，其余组合的好坏都是通过一个基于神经网络的机器学习算法来进行预测的。简单理解，这个机器学习算法是指工程师们先设定了一个值TREE，这个值的大小同时取决于产物滴度、生成速率和酶表达情况，这几项参数不同，得到的值就不一样，这几个参数表现得越好，TREE值就越高。

TREE = 滴度（Titer） × 产物生成速率（Rate）× 酶的表达水平（Enzyme expression）

拿实验数据训练算法的过程就是用这120组实验中的结果不断校正所提出的深度模型的参数，而当挑选一些算法预测出来的途径在宿主中进行验证时，结果表明深度学习算法对途径好坏的判断是可信的。（有关深度学习的具体内容将在本专辑的后续文章中详细介绍）

AI也可以是“老师傅”(来源于Tetris)

“名利场”之外的生命起源

在生物工程师眼里，一种技术的关注点在于如何把它的优点最大化，以便为人类社会创造更大的财富和好处。但无细胞表达系统的强大之处却不局限于工业微生物领域，它在理解什么是生命以及在寻找生命起源方面也拥有重要的意义。

著名的物理学家理查德·费曼讲过一句话“what I cannot creat, I do not understand”（我不能创造的即是我还不够理解的）。按照这个逻辑，对生命足够理解的一个标志是能够创造出来一个生命。

无细胞基因表达系统，讲求的是在体外不依赖完整的细胞去激活复杂的生物学过程，这个过程本质上是寻找更加精简和原始的生命形式。当科学家在体外用很明确的组分去组装一个细胞时，在成功让其显示出主要的生物学功能的前提下，所使用的组分越少，这些组分就越可能是原始生命形式的组成部分。

噬菌体渲染图（来源：Pinterest）

目前，利用无细胞系统组装细胞，科学家也取得了一些进展，已经可以利用无细胞系统组装较为简单的病毒。例如，早在2012年科学家就已经在体外成功将噬菌体T7 和ФX174组装成了具有自我复制的能力的病毒。另外在2018年，对于一个基因组更大的T4噬菌体，科学家也能利用无细胞基因表达系统在试管中成功组装出具有感染特性的病毒例子。

未来，无细胞基因表达系统的潜力值得期待。

你对未来无细胞基因表达系统有哪些想象？欢迎读者朋友们在评论区留下你对于无细胞表达系统的期待和疑问。

参考文献：

[1] Karim A S, Dudley Q M, Juminaga A, et al. In vitro prototyping and rapid optimization of biosynthetic enzymes for cell design[J]. Nature Chemical Biology, 2020, 16(8): 912-919.

[2] Silverman A D, Karim A S, Jewett M C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications[J]. Nature Reviews Genetics, 2019: 1-20.