王志珍：人工合成胰岛素中，一个少为人知的科学故事

　　1966年，中国科学家首次人工全合成具有全部生物活性的结晶牛胰岛素。听王志珍院士讲述在上世界60年代，人类在蛋白质科学研究中跨出的重要一步。

　　以下为王志珍演讲实录：

　　我是中国科学院生物物理研究所研究员王志珍。

　　我是一名研究蛋白质的生物化学家，我的研究生涯是从胰岛素研究开始的。今天我跟大家来谈一谈，半个世纪以前，中国科学家在人工合成胰岛素的创举中，一个少为人知的科学故事。

　　说起蛋白质，很多人就会想起高蛋白的食物，牛奶、鸡蛋、鸡鸭鱼肉、虾。不错，蛋白质是我们人体的必需营养。

　　什么是蛋白质呢？用革命导师恩格斯权威的哲学语言来说，“生命是蛋白体的存在形式”。

　　用科学语言来说，“蛋白质是生命活动的主要承担者”。不管是呼吸、消化、运动、说话，还是思维、学习、记忆，甚至感情等等，一切生命活动，都是由蛋白质分子或者说由很多蛋白质组成的“分子机器”来执行和完成的。

　　蛋白质是一种生物大分子，由各种各样的氨基酸组成。上图中，不同颜色的珠子代表不同种类的氨基酸，它们之间通过一种叫做“肽键”的化学键联系起来，形成肽链。

　　肽链就是蛋白质的一级结构，没有活性。只有当它在空间盘缠卷曲、折来折去，形成特定构象，才能获得生物学活性,成为蛋白质分子。

　　人体当中至少有2万种不同的蛋白质分子，每个蛋白质分子都有自己特定的结构。但组成这么多不同种类蛋白质的氨基酸，实际上也就是20来种。

　　我相信，每一位同志都知道什么是氨基酸。假如我说“谷氨酸”，你可能不知道；但是我说“味精”，你一定知道：味精是一种谷氨酸的钠盐（L-谷氨酸一钠）。

　　在这里，我要介绍的是“半胱氨酸”。图左下角，黄颜色的珠子代表半胱氨酸。两个半胱氨酸之间可以形成一种叫做“二硫键”的共价键。二硫键对于蛋白质分子的结构和功能非常重要。

　　到现在，我相信大家已经和我一起对蛋白质建立了新的认识：蛋白质是由氨基酸连接成的、通过折叠形成有复杂结构、特定形状，从而获得活性的生物大分子。

　　如果蛋白质的折叠发生了错误，就有可能引起疾病。大家知道的阿尔兹海默症（老年痴呆症）、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症（渐冻症）等等，都是神经退行性疾病。在患者的大脑里产生了某些蛋白由于错误折叠形成的斑块。

　　以上是今天讲座的铺垫。

　　现在我们来讲讲人工合成胰岛素。

　　1958年,中国科学院上海生物化学所为了向国庆十周年献礼，决定做一个有分量的项目，要“合成一个蛋白质”。这的确非常有分量，因为当时世界上没有成功的先例。有很多人经常把这件事情，说成是中国人跟诺贝尔奖擦肩而过、失之交臂的一个工作。

　　有那么多蛋白质，合成哪个呢？摆在中国科学家面前的选择其实就一个：胰岛素。因为胰岛素是当时唯一一个氨基酸序列已知的蛋白质。它的序列是1955年英国科学家Sanger测定的，他于1958获得诺贝尔奖。

　　胰岛素是一种激素蛋白，糖尿病者可以通过注射胰岛素降低血糖。同时它是一个很小的分子，只有51个氨基酸。

　　胰岛素分子由两条链组成，上面是A链，有21个氨基酸；下面是B链，有30个氨基酸。两条链中间，有两条红色的线，表示二硫键，且A链内部也还有一个二硫键。这样特殊的性质，恰恰给胰岛素的合成制造了一个瓶颈，而且还埋伏着当时完全不清楚的蛋白质折叠的问题。

　　这样一个很特殊的蛋白质分子，怎么去合成呢？当时提出了至少这样四种方案；但是由于技术和试剂方面的限制，只有方案一比较有希望。即：先分别合成A链和B链，再把A、B链通过二硫键接起来（重组）。

　　肽链的合成，在当时已经有过先例了。1952年，美国人合成了含有九个多肽的催产素，二年后就获得诺贝尔奖；1958年，又有人合成了十三肽的促黑激素。所以胰岛素合成的关键问题，就是合成的A链和B链能不能连起来，成为有活性的天然胰岛素分子。

　　上海生化所的邹承鲁小组担任了解决这个关键问题的任务。邹承鲁先生当年35岁，他组里所有的成员都比他年轻，有些还是大学刚刚毕业的。他们做的“胰岛素拆合”工作，就是把二硫键还原，拆开成两条分开的A链和B链，之后去寻找条件，看分开的A、B链能不能重新组合，成为天然的有活性的胰岛素。

　　“拆”跟“合”，听起来很简单，但其实实在是太困难了。因为胰岛素的A、B链重组的方式有无穷种。

　　我们设想一个理想的理论状态，就是在溶液里只有一条A链和一条B链，那么所有的半胱氨酸之间，形成二硫键的方式有15种。而真正的天然胰岛素只有左上角那一种，所以它的概率是1/15，也就是6.7%。

　　然而随着A、B链的数目在溶液中增加，两条链可以以不同比例与方式组合，二硫键可能的连接方式将呈现指数级的增长，也就是无穷种。但只有一种是天然胰岛素的结构，所以组合正确的概率是无穷分之一——相当于0。

　　然而一年多以后，邹承鲁小组居然找到了一组条件，使得他们从分开的A链和B链得到天然胰岛素的概率，从0.7%提高到1%，再提高到5%，最后竟然到了10%，可以说重组取得了成功。他们圆满地完成了任务，确定了方案一作为胰岛素的合成路线，开始了人工全合成胰岛素的攻关。

　　但当时出于对德国和美国科学家同类工作的保密，邹承鲁小组的工作并没有在国际上发表。1960年，《自然》杂志上发表了加拿大科学家类似的工作，但产率只有1%-2%，所以中国人的这个工作在国际上是领先的。

　　经过7年多的辛勤奋战，1966年，中国科学家人工全合成了具有全部生物活性的结晶牛胰岛素，右上角是合成的牛胰岛素的结晶；右下角是通过小白鼠惊厥测定胰岛素的活性。《人民日报》报道了这项工作。

　　在理论上几乎得不到的情况下，为什么邹承鲁小组能够得到相当高产率的天然胰岛素呢？

　　当时他们总结的原因是，“在所有可能的重氧化产物当中，胰岛素结构还是一种比较稳定的结构，甚至在各种AB异构物之中，还是最稳定的结构之一。”这个时候，他们就已经认识到了天然结构是最稳定的。

　　现在我必须跟大家谈一谈，同一时期美国科学家Anfinsen的“牛胰核糖核酸酶的变性和复性实验”。核糖核酸酶是一个酶蛋白，它只有一条链；但是它有八个半胱氨酸，所以形成了四对二硫键。加了还原剂和变性剂，这个分子就还原变性成一个伸展的链，失去了活性。Anfinsen把变性剂和还原剂去掉，看这一条链能不能重新折叠起来、氧化复性成为原来的分子结构。

　　Anfinsen最后找到了一个条件，得到了差不多有80%非常高产率的核糖核酸酶。他后来得出的结论是，多肽链氨基酸的序列已经含有了其三维结构的全部信息，也就是我们平常讲的“蛋白质一级结构决定高级结构”。他于1972年获得诺贝尔化学奖。

　　来对比一下中国科学家跟美国科学家面对的问题。时间上，都是在上世纪五六十年代。他们处理的问题，也都是多肽链中二硫键正确形成的问题：一个是变性和复性的实验，一个是拆开和重组的实验，非常相似。

　　美国人做的是牛胰核糖核酸酶（上图右侧），只是一条链，探究的是4对链内的二硫键。这个情况下，所有可能形成的搭配方式是105种，其中二硫键正确的核糖核酸酶只有一种，所以成功的概率是1/105，就是0.95%。

　　而中国科学家面对的问题是两条链的胰岛素（上图左侧）。它虽然只有6个半胱氨酸，但是由于两条链可以以不同的比例、不同的方式来组合，因此获得天然胰岛素的概率是无穷分之一，是0。所以中国科学家面对的问题实际上更加复杂。

　　Anfinsen在生命科学发展的那个阶段，是兴趣使然、自由探索。所以他在黑暗当中，一步一步地朝着前面出现的小亮点前进。最后看到了一扇亮灯的窗户，到了这扇窗户跟前，并最终推开了它，向人们展示了一个蛋白质科学中，崭新的蛋白质折叠的世界。而且他指出了，“天然蛋白质的结构是在生理条件下热力学上最稳定的结构”。

　　中国的科学家在那特定的社会条件下，是任务导向。其实他们在执行任务的过程当中，也必然会看到这扇窗户，到达这扇窗户前。然而，由于任务的催促和灾难性的文革的种种干扰，他们被带离了这扇窗户，没有机会去捅破那一层窗户纸。

　　一直到改革开放，郭老宣布科学的春天到来了，A、B链重组成功的基础理论研究才在中国科学院生物物理所扬帆起航。我本人也非常有幸参与了这项研究。

　　这就是我今天要给大家讲的，胰岛素合成背后的蛋白质折叠的故事。谢谢大家。

　　演讲嘉宾王志珍：《人工合成胰岛素中，一个少为人知的科学故事》